7A版发酵工程实验报告之果汁澄清Word格式.docx
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粘度降低法：
利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
脱胶作用时间法：
以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
次亚碘酸法：
用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。
还原糖法（DNS法）：
测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。
DNS法：
根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
4、微生物发酵生产产品受以下条件制约：
培养基成分：
C源、N源、无机盐、水和生长因子
培养条件：
温度、pH、溶解氧等
附加条件：
诱导物、表面活性剂等
5、酶催化反应的进行受多种因素的影响
底物浓度酶浓度温度pH激活剂抑制剂
三、实验材料
（一）试剂
1、酶活测定用试剂和DNS
2、新鲜果汁
（二）仪器
烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；
天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。
（三）培养基
1、菌种筛选使用
2、黑曲霉Asp-2固体发酵用
1、菌种筛选使用培养基
⑴基本培养基:
果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，琼脂2.0%。
⑵分离培养基
果胶0.5%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂2.0%，pH4.5
（3）发酵培养基
果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。
2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基
菌种斜面培养基（查氏培养基）
NaNO30.2%K2HPO40.1%
KCl0.05%MgSO40.05%
FeSO40.001%蔗糖3%
琼脂2.5%自然pH
种子培养基
麸皮3.0%，橘子粉2.0%，硫酸铵0.5%,
葡萄糖1%，KH2PO40.1%pH4.5
固体发酵培养基：
5瓶/组
麸皮10g，橘子粉2.5g，（NH4）SO40.1g（0.8%干料计）
葡萄糖0.125g（1%干料计），水15ml
要求：
按组统一配制后分装三角瓶
先将（NH4）SO4、葡萄糖用水溶解，再加其它。
四、实验方法、步骤及注意事项：
（1）固体发酵果胶酶
1、菌种准备
菌种活化：
试管保存菌种→斜面活化→30℃培养约60h
液体培养：
将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内，30℃，200rpm，培养约40h，备用。
2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响（第一组）
选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。
在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约5%，即1.5ml）相同培养条件下（30℃，60h）发酵，测定酶活。
3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响（第二组）
选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。
在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%、3.%的选择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%，即1.5ml），相同培养条件下，30℃，发酵60h，测定酶活。
4、培养基含水量对产酶的影响（第三组）
在发酵培养基中加入蒸馏水，使培养基中的含水量分别约为50%、55%、60%、65%和70%；
保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5%，即1.5ml）相同培养条件下（30℃，48~60h）发酵，测定酶活。
5、接种量对产酶的影响（第三组）
分别以4%、5%、6%、7%和8%的接种量接种果胶酶产生菌于发酵培养基中，在相同的培养条件下（30℃，48~60h）发酵，测定酶活。
注意：
由于接种的是液体菌种，所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。
6、发酵时间对产酶的影响（第四组）
在相同的培养基、相同的接种量（5%，即1.5ml）和相同培养条件下（30℃）分别发酵36、48、60、72和84h，测定酶活。
精确计算时间，准时取出发酵产物。
7、发酵温度对产酶的影响（第五组）
保持培养基成分和接种量（5%，即1.5ml）不变，分别
在室温、30、37和45℃的温度条件下发酵48－60h，
测定酶活。
先把培养箱调到相应的温度！
8、果胶酶酶活的测定
（1）待测酶液的制备
烘干：
把发酵产物倒于平皿中，45℃烘干过夜；
制备酶粉：
将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；
制备酶液：
称取0.1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释100倍），纱布（4层）过滤去除杂质；
如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。
（2）果胶酶酶活测定方法
OD=（A+B）/2
酶活定义：
在pH3.0、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式
酶活（U/g）=A×
5×
K×
N×
1000/（T×
W×
M）
A:
样品的OD值（平均值）
K:
标准曲线的斜率
N:
稀释倍数
5：
0.2毫升反应液转换为1毫升体积
T:
反应时间（min）
1000：
转换因子1mmol=1000μmol
W:
半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol）
M:
称取酶粉克数（g）
绘制标准曲线的方法
先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。
然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。
半乳糖醛酸标准曲线的制作
精确称取0.100g半乳糖醛酸，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的半乳糖醛酸的标准溶液。
标准曲线如下图表所示
（3）注意事项
试管上编号：
贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
移液枪的使用：
向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！
精确记时：
每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：
煮沸和用流水冲洗时；
实验结果的记录与分析
9、仪器的使用
恒温水浴锅
分光光度计
烘箱
移液枪
UV20GG型分光光度计的使用注意
提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；
将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室；
调节测定所用波长；
读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30％酒精中。
注意事项
1、接种
接种方式是液体→固体，用灭菌的移液管或10ml量筒接种或大枪头；
接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。
2、水浴锅的使用：
水量（蒸馏水）要超过试管中的液面
3、分光光度计使用时注意：
测定OD在540nm、以对照为参比、测定吸光值
4、及时清洗用过的枪头
实验准备内容
（1）黑曲霉Asp-2固体发酵用的培养基
5瓶/组→注意配方等的不同，做好标记！
（2）灭菌
培养基
其它：
10ml量筒（纱布和报纸包口）、移液管（塞棉花）等
时间：
灭菌45min
1、酶粉的选择：
同一大组采用同一酶粉进行应用性质的实验！
2、水浴锅的使用
水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面
各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行
3、分光光度计使用时注意
OD660nm
以蒸馏水为参比
测定透光率
五、实验报告
（一）、实验结果
本次实验在菌种分离时，已经分离到能产生果胶酶的菌株，但是在后期的培养过程中，发生一点点的错误，导致培养出来的菌种没有酶活，也就是实验失败。
（二）结果分析
从培养的初期来看，实验能得到菌种，说明实验有成功的契机，但是在经过发酵培养之后，菌株没有酶活，也就是在发酵培养时出现意外，本次试验提醒我们做实验和做事要仔细认真，步步为营。
（二）应用发酵制备的酶液进行果汁澄清的应用实验
第十四周
六、实验目的：
了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素
七、实验原理：
1、果胶酶的应用：
2、脱胶作用时间法：
3、次亚碘酸法：
4、还原糖法（DNS法）：
八、实验材料
1、仪器设备：
2、材料：
新鲜果汁、NAOH溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲、DNS试剂
等等。
九、实验方法、步骤及注意事项：
（一）待测酶液的制备
1、制备酶液：
称取1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释10倍），高速冷冻离心（10000转、5min）去除杂质；
2、根据发酵条件优化实验中测定所得OD值大小，选择酶活最高的酶粉制备酶液。
（二）果汁的制备
1、水果→清洗→破碎→榨汁
2、稀释：
用pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至10倍
（三）果胶酶的应用性实验—果汁澄清实验
1、果汁澄清的基本方法
步骤
样品A管
样品B管
空白管
步骤1
吸取稀释果汁10毫升
步骤2
45℃保温5min
步骤3
稀释酶液1mL
不加
步骤4
45℃精确保温30min
步骤5
离心（5000转，5分钟）
步骤6
以蒸馏水为参比，660nm测定透光率
T（透光率）=（A+B）/2△T＝︱T－T0︱空白为T0
2、果胶酶添加量对澄清效果的影响（1，2组）
（1）在反应体系中分别加入0.2、0.5、1.0、1.5和2.0ml的果胶酶液
（2）在相同的反应条件（pH3.0，45℃）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光率。
3、果汁pH对澄清效果的影响（3，4组）
（1）用0.25mol/LH2SO4和3mol/LNaOH分别调节果汁的pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；
（2）在反应体系中加入1.0ml的果胶酶液，相同的反应条件（45℃）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光率。
4、果汁温度对澄清效果的影响（5，6组）
（1）保持反应体系的其它条件（1.0ml的果胶酶液、pH3.0，30min）不变，分别在室温（温度计测定）、37℃、45℃、50℃、55℃条件下进行反应30Min;
（2）以蒸馏水为参比分别测定透光率。
（四）注意事项
1、水浴锅的使用
（1）水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面
（2）各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行
2、分光光度计使用时注意
（1）OD660nm
（2）以蒸馏水为参比
（3）测定透光率
一十、实验结果及分析
1、对不同的实验组添加不同的果胶酶的量后得到的结果如下:
（表一）果胶酶添加量对果汁澄清的影响
酶液量（ml）
OD660
平均值（T）
空白（TO）
△T＝︱T－T0︱
A管
B管
0.2
45.90%
74.00%
59.95%
11.60%
48.35%
0.5
39.10%
42.70%
40.90%
12.10%
28.80%
1.0
54.30%
37.40%
45.85%
11.40%
34.45%
1.5
21.80%
9.30%
15.55%
11.90%
3.65%
2.0
47.30%
48.90%
48.10%
12.00%
36.10%
根据上表格做出的折线图（图一）如下：
【透光率之差（△T＝︱T－T0︱）】
分析：
根据表格数据及折线图中的信息可以看出△T随着酶量的增加逐渐下降，到酶量为1.5ML时突然上升。
但是根据理论分析随着酶量的增加△T的值应该是逐渐上升，直到某一浓度之后不再增加。
出现上图的结果说明实验没有成功，可能的原因有：
（1）可能是测OD值时把管号弄混了；
（2）可能是加酶时出现漏加现象；
（3）从表一中A、B管数据的分布来看，该实验数据的准确性太低，波动大，可信度低。
由于种种原因，本次实验未能找出最适加酶量。
2、不同PH的果汁对果汁澄清效果有影响的实验结果如下
（表二）果汁PH对澄清效果的影响
PH
管号
空白管（TO）
A
19.60%
19.50%
20.60%
1.10%
B
19.10%
23.50%
2.90%
35.00%
2.5
61.80%
64.00%
43.40%
66.10%
3.0
74.60%
65.50%
44.90%
66.30%
3.5
80.40%
80.50%
59.90%
80.80%
4.0
91.90%
93.50%
72.90%
95.00%
4.5
64.40%
63.00%
42.40%
5.0
36.40%
28.00%
7.40%
20.30%
根据表二做出折线图（图二）如下：
从表二中的数据来看，A、B两管的数值差距不大，可信度较高，从图二可以看出随着PH的升高△T不断的升高，当达到一定的高度之后，△T又逐渐下降，在PH=4时△T的值达到最高为72.90%。
也就是说当果汁的PH=4时果汁澄清的效果最好，即最适的果汁澄清PH为4。
建议在今后的实验中用PH=4的果汁进行实验，效果会更好。
3、不同反应温度对果汁澄清效果的影响
（表三）不同反应温度对果汁澄清效果的影响
温度（℃）
△T=T-TO
室温（27）
77.40%
76%
76.70%
12.20%
64.50%
37
96.50%
96.60%
96.55%
84.35%
45
80.65%
79.60%
80.13%
67.93%
50
54.70%
48.20%
51.45%
39.25%
55
44.60%
44.50%
44.55%
32.35%
根据表三作得折线图（图三）如下：
从表三的数据可以看到A、B两管的实验数据差距不大，可以采用，从折线图中可以看到，△T的值随着温度的升高而升高，当到达一定的温度时△T的值达到最大，之后△T的值又逐渐下降，曲线呈现抛物线型，有一个最高点（37℃,84.35%），也就说明在温度为37℃时果汁的澄清效果最好。
通过本次实验，我们测量到了果胶酶的最适温度为37℃，建议今后在用道果胶酶时在37℃下使用。
六、实验总结
通过本次实验，我们测量了果胶酶的最适果汁PH、最适反应温度以及最佳的加酶量，得到了该果胶酶的最适果汁PH为PH=4.0，改果胶酶的最适温度为37摄氏度，但是由于种种的原因，我们没有把最佳加酶量测量出来。
在本次实验中，小组的各成员积极参与，协调合作，出色的把我们小组负责的工作完成了。
通过本次实验我们知道了合作的重要性，对于在本次实验中出现的错误，我们会在今后的学习工作中改进的。
七、教师评语及评分：
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