胶原蛋白的提取1.docx

1、胶原蛋白的提取1 本文由grearsky6贡献 doc文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT，或下载源文件到本机查看。 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 目 录 英文缩写对照表1 中文摘要2 英文摘要4 1 前言6 2 材料6 2.1 主要仪器设备6 2.2 实验动物7 2.3 样品与试剂8 2.4 常用工作液8 3 方法9 3.1 CP的制备9 3.1.1 粗提法9 3.1.2 高效液相色谱分离纯化 10 3.2 CP的理化性质鉴定 10 3.2.1 37 OC 凝结试验 11 3.2.2 紫外吸收值测定 11 3.2.3 氨基酸组

2、成和含量分析 11 3.2.4 蛋白质浓度测定 11 3.2.5 SDS-PAGE 凝胶电泳12 3.2.6 RP-HPLC 分析 CP 12 3.2.7 生物安全性实验 13 3.3 CP防止 UVA 氧化损伤实验14 3.3.1 L929 细胞的培养、 冻存与复苏14 3.3.2 UVA 对 L929 细胞活性的影响 14 3.3.3 CP对细胞 UVA 氧化损伤的保护作用14 4 结果 16 4.1 CP的制备 16 4.2 CP的理化性质鉴定 16 1 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 4.2.1 37 OC 凝结试验 16 4.2.2 紫

3、外吸收值测定 16 4.2.3 CP氨基酸组成和含量分析 17 4.2.4 蛋白质浓度测定 18 4.2.5 SDS-PAGE 凝胶电泳19 4.2.6 RP-HPLC 分析 CP19 4.2.7 生物安全性试验 20 4.3 CP防止 UVA 氧化损伤实验 22 4.3.1 UVA 对 L929 细胞活性的影响 22 4.3.2 CP对细胞 UVA 氧化损伤的保护作用 22 5、讨论25 5.1 CP的制备 25 5.1.1 提高 CP得率的因素25 5.1.2 提高 CP纯度的因素26 5.1.3 高效液相色谱是分离纯化 CP的有效途径 27 5.2 CP的理化性质鉴定 27 5.2.1

4、CP在 223nm 处有紫外最大吸收值 27 5.2.2 CP氨基酸组成及含量分析 27 5.2.3 SDS-PAGE 鉴定28 5.2.4 RP-HPLC 分析 CP 28 5.2.5 CP具有生物安全性 28 5.3 CP防止 UVA 氧化损伤研究 29 5.3.1 UVA 对成纤维细胞有活性有抑制作用 29 5.3.2 CP能够降低 UVA 氧化损伤的细胞 MDA 活性 30 5.3.3 CP能够提高 UVA 氧化损伤细胞的 GSH-px 活性 30 小结 31 参考文献 32 文献综述 胶原蛋白的研究进展 37 致谢 46 2 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧

5、化损伤作用的初步研究 英文缩写对照表 英文缩写 英文缩写 CP A BPB ddH2O PBS 英文名称 Collagen protein Absorbance Bromophenol blue Double distilled water Phosphate buffered saline 中文名称 型胶原蛋白 吸光值 溴酚蓝 双蒸水 磷酸盐缓冲液 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠 三（羟甲基）氨基甲烷 SDS-PAGE SDS-polyacrylamidegel electrophoresis SDS Tris TEMED DMSO CBB MTT Sodium dodecyl sulf

6、ate Tris(hydroxymethyl)aminomethane N,N,NN-tetra methylethylene diamine N,N,NN-四甲基乙二胺 Dimethyl sulphoxide Coomassie Brillant Blue 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 -diphenyl tetrazolium bromide 二甲基亚砜 考马斯亮蓝 噻唑蓝 HPLC UVA MDA GSH-px High performance liquid chromatography Ultraviolet radiation A Malondi

7、aldehyde Glutathione peroxidase 高效液相色谱 长波紫外线 丙二醛 谷胱甘肽过氧化物酶 3 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 型胶原蛋白的制备、鉴定及其 型胶原蛋白的制备、 抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 学科专业： 学科专业 ： 动 物 学 指导教师： 指导教师 ： 魏泓 教授 研究方向： 研究方向 ： 生 化 制药 2001345） 研 究 生 ： 王 琳 （ 2001345） 内 容 摘 要 本文围绕型胶原蛋白（CP）的制备及其理化性质进行研究，同时在其 防止长波紫外线（UVA）对细胞的氧化损伤方面进行了初步

8、探索，为CP的进 一步研发提供理论基础和科学依据。 以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得 率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CP的分离纯 化。 CP理化性质鉴定结果表明：样品在223 nm处有紫外最大吸收值；含有十 八种氨基酸， 氨基酸总量在90%以上； 样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml； SDS-PAGE 测定CP由、三条链组成；色谱分析纯度约为100%。通过小鼠急性毒 性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CP进行整体水平和细胞水平的 生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿 情况；细胞毒性小于级，结果

9、证明本方法制备的CP无毒副作用。 评价 CP对 UVA 氧化损伤的 L929 细胞的保护作用。结果表明：随着 UVA 照射时间的延长， 细胞的活性明显降低， 说明 UVA 对细胞的氧化损伤是明显的， 其中表现为 MDA 的含量升高、GSH-px 的含量降低。加入不同浓度的 CP后照 射同样的时间，MDA 的含量有所下降、GSH-px 的含量有所升高，其中 50%CP 组的效果极为显著（P0.01） 。提示该物质有防止 UVA 氧化损伤的作用。 综上所述， 利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯 4 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究

10、 化 CP，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全 性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的 UVA 氧化损伤具有较好的保护作用。 关键词： 关键词 ： 型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤 5 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 Studies on the preparation，identification of CPand its ， protective effect on cells damaged by UVA Major : Biology Tutor : Prof. Wei H

11、ong Speciality : Zoology Author : Wang Lin（2001345） Abstract In this paper,how to prepare CPand identify physico-chemical property had been studied, and UVA oxidative damage L929 was perliminary discussed. These datas provided theoretic foundation and scientific proof for further research and develo

12、pment of this product. Pigskin was used as material. According to the comparation among the three kinds of crude extraction methods including acid dissolve,enzymolysis and neutral salt solution. The method of enzymolysis combined with HPLC was chosen to prepare CP . The physico-chemical property of

13、CPwas identified. The results showed that: CP showed character absorption peak at 223nm; CPhad 18 kinds of amino acids, total count of amino acid was more than 90%; the concentration of protein was 1.03 mg/ml; CPwas composed of chain,chain and chain by SDS-PAGE; One pure peak with HPLC was founded a

14、nd its purity was 100%. The security of CP according to the experiments of mice accute toxicity was evaluated, Guinea pig sensitization and cytotoxicity experiment in integer level and cell level. It was showed that : the mice had no toxic reaction; the Guinea pigs points of injection had no erythem

15、a and dropsy; the cytotoxicity was lower thanclass. The results proved that CPhad no poison side effects. CPprevented UVA from oxidative damaging L929 was studied. The activity of 6 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 cells became weaker and weaker with exposure time. It was conspicuous that UVA

16、 damaged the activity of cells. The contents of MDA upgraded and the contents of GSH-px degraded. When adding different concentration of CP, the contents of MDA decreased and that of GSH-px increased. The effect of 50 % concentration group was extremely remarkable (P0.01). It showed that CPcan count

17、eract oxidative damage from UVA. In conclusion, the method of enzymolysis combined with HPLC to extract CP from pigskin was proposed. This method showed the adventages of high performance, high selectivity and easily amplification. Acoording to the experiments of identifying the physico-chemical pro

18、perty and the biosafety of CP, it was concluded that CP had high bioactivity and no toxicity effect, and that CPhad the ability to protect cells from oxidative damnification. . Key words : CP, high performance liquid chromatography, physico-chemical property , identification, oxidative damnification

19、 7 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 1 前言 型胶原蛋白（Collagen Protein）是一组由多种糖蛋白组成的大家族，不 仅具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和抵抗原性 ，而且具有 一系列重要的生物学功能，如：具有明显的提高人体免疫功能与改变心肌功能作 用；保护胃粘膜以及抗溃疡作用；抗过敏作用；抑制血压上升作用；其中某些特 殊氨基酸还具有防癌作用 。因此型胶原蛋白在生物医学材料、美容保健、药 物缓释等诸多领域具有良好的应用前景。 型胶原蛋白由于其结构复杂，生物学特性各异，因此从生物组织中纯化 型胶原蛋白比较困难。关于型胶原蛋白

20、的分离纯化工作，国内相关报道不多， 常见的提纯方式只是简单的利用一步柱层析进行3，此方法存在生产周期长、分 离效率低、产物纯度不高等缺点。长的分离周期和低的分离效率不仅增加了胶原 蛋白的生产成本，而且使很多资源无法得到有效的利用。本文在此基础上对制备 工艺进行改进，使用酶解和高效液相色谱相结合的方法，从猪皮中分离纯化型 胶原蛋白。高效液相色谱具有操作条件温和，选择性高，批处理量大和操作自动 化等优点 ，是分离纯化胶原蛋白的有效方法。本文探索了型胶原蛋白的提取 方法，为其高效制备工艺的形成提供有力的技术依据。 近年来由于臭氧层的破坏而使长波紫外线辐射增强， 长期的紫外线辐射会导 致皮肤老化，黑色

21、素瘤及多种皮肤癌等病变5-8。自由基抑制剂或清除剂能防止 紫外线的氧化损伤，保护皮肤，延缓皮肤衰老910。以往的研究多是集中于天然 植物提取物的抗氧化作用，而对动物活性物质抗氧化作用的研究少见报道。本文 在建立UVA氧化损伤L929细胞模型的基础上，探索型胶原蛋白防止UVA氧化 损伤的作用和机理，为具有抗UVA氧化损伤作用的活性物质的开发开辟新的领 域。 因此，本文选取型胶原蛋白作为研究对象，通过对型胶原蛋白的提取分 离、理化性质及生物功能的研究，为型胶原蛋白产品的深入开发提供必要的技 术支持。 4 2 1 2 材料 2.1 主要仪器设备 8 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 U

22、VA 氧化损伤作用的初步研究 CR22G 型高速冷冻离心机，日本 HITACHI 株式会社； FTS 系列冻干机，Dupont 公司； 79 型控温多用高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂； BD-462 型冰柜、SC-320 型冷藏箱，青岛澳柯玛股份有限公司； LS-B501 型立式圆形压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂； 电泳仪，美国 BIO-RAD 公司； QPLS-22 型不锈钢绞肉机，江苏丹徒县纪庄食品机械铸件厂； ZT-2000 型圆筒式过滤器，绍兴市卫星医疗设备制造有限公司； UV751，GD 紫外/可见光分光光度计，上海分析仪器厂； SPX250B 型系列生化培养箱，上海跃进医疗

23、器械厂； PB310S 型电子天平，北京赛乌利斯有限公司； LAC 214 型电光分析天平，常熟市衡器厂； HHS-8S 电热恒温水浴锅，上海天平仪器厂； B5060 型二氧化碳培养箱，美国 HERAEUS 公司； COTC 型倒置显微镜，重庆光学仪器厂； 紫外线灯管(UVA)，北电光源研究所； SXK-103 型超净工作台，安徽省蚌埠净化设备厂； 超声波细胞粉碎机，宁波东芝生物技术有限公司； 550 型酶标仪，美国 BIO-RAD 公司； HP-1100 型高效液相色谱仪，Agilent 公司； ZORBAX 300 SB-C18 半制备色谱柱（9.4mm25cm） ，Agilent 公司；

24、 Hypersil ODS C18 分析柱（4.0mm250mm） ，Agilent 公司； FC 203B 馏分收集仪（Fraction Collector） ，美国 Gilson 公司； 8453E 型紫外分光光度系统，Agilent 公司； 高速氨基酸自动分析仪，6300 黄金系统，美国贝可曼公司； 2.2 实验动物 2.2.1 豚鼠 英国种封闭群，普通级，健康，雌雄均可，体重 250350g，试验前及试验 后的观察期内，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的动物不得重复利用。由 9 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 第三军医大学实验动物中心提

25、供。 2.2.2 小鼠 昆明 （KM） 小鼠， 普通级， 健康， 68 周龄， 1822g， 合格证号： 310101014， 由第三军医大学实验动物中心提供。 2.3 样品与试剂 市售猪皮； NIH3T3 细胞，L929 细胞，由第三军医大学免疫教研室提供； 型胶原蛋白对照品，Sigma 公司； 胃蛋白酶（1：2500） ，Sigma 公司； 胰蛋白酶，Sigma 公司； 甲醇，Merck 公司； 羟脯氨酸对照品，南京建成生物工程研究所； DMEM 培养基干粉，美国 GIBCO 公司； 小牛血清，兰州民海生物工程公司； 丙烯酰胺，Tianjin,H&Y. Bio,Co;Ltd； 甲叉双丙烯酰

26、胺，Tianjin,H&Y. Bio,Co;Ltd； TEMED，Promega Corporation; 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所； MTT，Sigma 公司； DMSO，上海生工有限公司； 分子量蛋白 Marker，上海生物化学研究所； MDA 活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所； GSH 活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所； 其它试剂均为国产分析纯。 2.4 常用工作液 D-Hanks 溶液：将 NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g， Na2HPO4.7H2O 0.06g，酚红 0.02g，加 ddH2O

27、 至 1000ml 溶解，0.07Mpa 高压 灭菌 15min。 双抗储备液：将青霉素 100 万单位，链霉素 100 万单位溶于 10ml ddH2O， 10 理学硕士学位论文：型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗 UVA 氧化损伤作用的初步研究 即为每毫升含青霉素 10 万单位，链霉素 10 万单位的双抗储备液，-20 OC 保存。 DMEM 培养液：DMEM 培养基干粉 10g，双抗储备液 1ml, NaHCO3 2.0g， 用三蒸水溶解，定容至 1000 ml。溶液用 5.6% NaHCO3 调 pH 至 7.2 左右，不锈 钢滤器除菌分装， 此为不完全 DMEM 培养液， 加入 20%小牛

28、血清后为完全 DMEM 培养液，-20 C 保存。 胰蛋白酶液： 0.25g 胰蛋白酶粉末溶于 100ml 的 PBS 中， 将 即为 0.25%胰蛋 白酶液。 丙烯酰胺单体贮液：将 14.55g 丙烯酰胺和 0.45g 甲叉双丙烯酰胺溶解于 40 ml 的 ddH2O 中，搅拌直到溶液变成透明，再加 ddH2O 至 50ml，过滤，装入棕 色瓶，4OC 可保存一个月。 浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCL，pH 6.8） ：将 6.06g Tris 溶解在 40 ml 的 ddH2O 中，用 4mol/L HCL 调节 pH 至 6.8，再加 ddH2O 至 50ml，4 C 保存。 分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCL，pH 8.8） ：将 9.08g T