胶原蛋白的提取1.docx

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胶原蛋白的提取1

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理学硕士学位论文：

Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究

目

录

英文缩写对照表………………………………………………………………………1中文摘要………………………………………………………………………………2英文摘要………………………………………………………………………………41前言…………………………………………………………………………………62材料…………………………………………………………………………………62.1主要仪器设备……………………………………………………………………62.2实验动物…………………………………………………………………………72.3样品与试剂………………………………………………………………………82.4常用工作液………………………………………………………………………83方法…………………………………………………………………………………93.1CPⅠ的制备………………………………………………………………………93.1.1粗提法…………………………………………………………………………93.1.2高效液相色谱分离纯化……………………………………………………103.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………103.2.137OC凝结试验………………………………………………………………113.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………113.2.3氨基酸组成和含量分析……………………………………………………113.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………113.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………123.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………123.2.7生物安全性实验……………………………………………………………133.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………143.3.1L929细胞的培养、冻存与复苏………………………………………………143.3.2UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………143.3.3CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………144结果………………………………………………………………………………164.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………164.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………16

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Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究

4.2.137OC凝结试验………………………………………………………………164.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………164.2.3CPⅠ氨基酸组成和含量分析………………………………………………174.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………184.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………194.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………194.2.7生物安全性试验……………………………………………………………204.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………224.3.1UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………224.3.2CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………225、讨论………………………………………………………………………………255.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………255.1.1提高CPⅠ得率的因素………………………………………………………255.1.2提高CPⅠ纯度的因素………………………………………………………265.1.3高效液相色谱是分离纯化CPⅠ的有效途径………………………………275.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………275.2.1CPⅠ在223nm处有紫外最大吸收值………………………………………275.2.2CPⅠ氨基酸组成及含量分析………………………………………………275.2.3SDS-PAGE鉴定………………………………………………………………285.2.4RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………285.2.5CPⅠ具有生物安全性………………………………………………………285.3CPⅠ防止UVA氧化损伤研究…………………………………………………295.3.1UVA对成纤维细胞有活性有抑制作用……………………………………295.3.2CPⅠ能够降低UVA氧化损伤的细胞MDA活性…………………………305.3.3CPⅠ能够提高UVA氧化损伤细胞的GSH-px活性………………………30小结…………………………………………………………………………………31参考文献……………………………………………………………………………32文献综述胶原蛋白的研究进展…………………………………………………37

致谢…………………………………………………………………………………46

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Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究

英文缩写对照表

英文缩写英文缩写

CPⅠABPBddH2OPBS

英文名称

CollagenproteinⅠAbsorbanceBromophenolblueDoubledistilledwaterPhosphatebufferedsaline

中文名称

Ⅰ型胶原蛋白吸光值溴酚蓝双蒸水磷酸盐缓冲液聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠三（羟甲基）氨基甲烷

SDS-PAGESDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDSTrisTEMEDDMSOCBBMTTSodiumdodecylsulfateTris（hydroxymethyl）aminomethane

N,N,N’N’-tetramethylethylenediamineN,N,N’N’-四甲基乙二胺DimethylsulphoxideCoomassieBrillantBlue3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide二甲基亚砜考马斯亮蓝噻唑蓝

HPLCUVAMDAGSH-px

HighperformanceliquidchromatographyUltravioletradiationAMalondialdehydeGlutathioneperoxidase

高效液相色谱长波紫外线丙二醛谷胱甘肽过氧化物酶

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Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究

Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其型胶原蛋白的制备、抗UVA氧化损伤作用的初步研究

学科专业：

学科专业：

动物学指导教师：

指导教师：

魏泓教授

研究方向：

研究方向：

生化制药2001345）研究生：

王琳（2001345）

内容摘要

本文围绕Ⅰ型胶原蛋白（CPⅠ）的制备及其理化性质进行研究，同时在其防止长波紫外线（UVA）对细胞的氧化损伤方面进行了初步探索，为CPⅠ的进一步研发提供理论基础和科学依据。

以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CPⅠ的分离纯化。

CPⅠ理化性质鉴定结果表明：

样品在223nm处有紫外最大吸收值；含有十八种氨基酸，氨基酸总量在90%以上；样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml；SDS-PAGE测定CPⅠ由α、β、γ三条链组成；色谱分析纯度约为100%。

通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CPⅠ进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿情况；细胞毒性小于Ⅰ级，结果证明本方法制备的CPⅠ无毒副作用。

评价CPⅠ对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。

结果表明：

随着UVA照射时间的延长，细胞的活性明显降低，说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的，其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。

加入不同浓度的CPⅠ后照射同样的时间，MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高，其中50%CPⅠ组的效果极为显著（P﹤0.01）。

提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。

综上所述，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯

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化CPⅠ，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。

关键词：

关键词：

Ⅰ型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤

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Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究

Studiesonthepreparation，identificationofCPⅠandits，ⅠprotectiveeffectoncellsdamagedbyUVA

Major:

BiologyTutor:

Prof.WeiHong

Speciality:

ZoologyAuthor:

WangLin（2001345）

Abstract

Inthispaper,howtoprepareCPⅠandidentifyphysico-chemicalpropertyhadbeenstudied,andUVAoxidativedamageL929wasperliminarydiscussed.Thesedatasprovidedtheoreticfoundationandscientificproofforfurtherresearchanddevelopmentofthisproduct.Pigskinwasusedasmaterial.Accordingtothecomparationamongthethreekindsofcrudeextractionmethodsincludingaciddissolve,enzymolysisandneutralsaltsolution.ThemethodofenzymolysiscombinedwithHPLCwaschosentoprepareCPⅠ.Thephysico-chemicalpropertyofCPⅠwasidentified.Theresultsshowedthat:

CPⅠshowedcharacterabsorptionpeakat223nm;CPⅠhad18kindsofaminoacids,totalcountofaminoacidwasmorethan90%;theconcentrationofproteinwas1.03mg/ml;CPⅠwascomposedofαchain,βchainandγchainbySDS-PAGE;OnepurepeakwithHPLCwasfoundedanditspuritywas100%.ThesecurityofCPⅠaccordingtotheexperimentsofmiceaccutetoxicitywasevaluated,Guineapigsensitizationandcytotoxicityexperimentinintegerlevelandcelllevel.Itwasshowedthat:

themicehadnotoxicreaction;theGuineapig’spointsofinjectionhadnoerythemaanddropsy;thecytotoxicitywaslowerthanⅠclass.TheresultsprovedthatCPⅠhadnopoisonsideeffects.CPⅠpreventedUVAfromoxidativedamagingL929wasstudied.Theactivityof

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cellsbecameweakerandweakerwithexposuretime.ItwasconspicuousthatUVAdamagedtheactivityofcells.ThecontentsofMDAupgradedandthecontentsofGSH-pxdegraded.WhenaddingdifferentconcentrationofCPⅠ,thecontentsofMDAdecreasedandthatofGSH-pxincreased.Theeffectof50%concentrationgroupwasextremelyremarkable（P<0.01）.ItshowedthatCPⅠcancounteractoxidativedamagefromUVA.

Inconclusion,themethodofenzymolysiscombinedwithHPLCtoextractCPⅠ

frompigskinwasproposed.Thismethodshowedtheadventagesofhighperformance,highselectivityandeasilyamplification.Acoordingtotheexperimentsofidentifyingthephysico-chemicalpropertyandthebiosafetyofCPⅠ,itwasconcludedthatCPⅠhadhighbioactivityandnotoxicityeffect,andthatCPⅠhadtheabilitytoprotectcellsfromoxidativedamnification..

Keywords:

CPⅠ,highperformanceliquidchromatography,physico-chemical

property,identification,oxidativedamnification

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Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究

1前言

Ⅰ型胶原蛋白（CollagenProteinⅠ）是一组由多种糖蛋白组成的大家族，不仅具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和抵抗原性，而且具有一系列重要的生物学功能，如：

具有明显的提高人体免疫功能与改变心肌功能作用；保护胃粘膜以及抗溃疡作用；抗过敏作用；抑制血压上升作用；其中某些特殊氨基酸还具有防癌作用。

因此Ⅰ型胶原蛋白在生物医学材料、美容保健、药物缓释等诸多领域具有良好的应用前景。

Ⅰ型胶原蛋白由于其结构复杂，生物学特性各异，因此从生物组织中纯化Ⅰ型胶原蛋白比较困难。

关于Ⅰ型胶原蛋白的分离纯化工作，国内相关报道不多，常见的提纯方式只是简单的利用一步柱层析进行[3]，此方法存在生产周期长、分离效率低、产物纯度不高等缺点。

长的分离周期和低的分离效率不仅增加了胶原蛋白的生产成本，而且使很多资源无法得到有效的利用。

本文在此基础上对制备工艺进行改进，使用酶解和高效液相色谱相结合的方法，从猪皮中分离纯化Ⅰ型胶原蛋白。

高效液相色谱具有操作条件温和，选择性高，批处理量大和操作自动化等优点，是分离纯化胶原蛋白的有效方法。

本文探索了Ⅰ型胶原蛋白的提取方法，为其高效制备工艺的形成提供有力的技术依据。

近年来由于臭氧层的破坏而使长波紫外线辐射增强，长期的紫外线辐射会导致皮肤老化，黑色素瘤及多种皮肤癌等病变[5-8]。

自由基抑制剂或清除剂能防止紫外线的氧化损伤，保护皮肤，延缓皮肤衰老[9][10]。

以往的研究多是集中于天然植物提取物的抗氧化作用，而对动物活性物质抗氧化作用的研究少见报道。

本文在建立UVA氧化损伤L929细胞模型的基础上，探索Ⅰ型胶原蛋白防止UVA氧化损伤的作用和机理，为具有抗UVA氧化损伤作用的活性物质的开发开辟新的领域。

因此，本文选取Ⅰ型胶原蛋白作为研究对象，通过对Ⅰ型胶原蛋白的提取分离、理化性质及生物功能的研究，为Ⅰ型胶原蛋白产品的深入开发提供必要的技术支持。

[4][2][1]

2材料

2.1主要仪器设备

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CR22G型高速冷冻离心机，日本HITACHI株式会社；FTS系列冻干机，Dupont公司；79型控温多用高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂；BD-462型冰柜、SC-320型冷藏箱，青岛澳柯玛股份有限公司；LS-B501型立式圆形压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂；电泳仪，美国BIO-RAD公司；QPLS-22型不锈钢绞肉机，江苏丹徒县纪庄食品机械铸件厂；ZT-2000型圆筒式过滤器，绍兴市卫星医疗设备制造有限公司；UV751，GD紫外/可见光分光光度计，上海分析仪器厂；SPX250B型系列生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；PB310S型电子天平，北京赛乌利斯有限公司；LAC214型电光分析天平，常熟市衡器厂；HHS-8S电热恒温水浴锅，上海天平仪器厂；B5060型二氧化碳培养箱，美国HERAEUS公司；COTC型倒置显微镜，重庆光学仪器厂；紫外线灯管（UVA），北电光源研究所；SXK-103型超净工作台，安徽省蚌埠净化设备厂；超声波细胞粉碎机，宁波东芝生物技术有限公司；550型酶标仪，美国BIO-RAD公司；HP-1100型高效液相色谱仪，Agilent公司；ZORBAX300SB-C18半制备色谱柱（9.4mm×25cm），Agilent公司；HypersilODSC18分析柱（4.0mm×250mm），Agilent公司；FC203B馏分收集仪（FractionCollector），美国Gilson公司；8453E型紫外分光光度系统，Agilent公司；高速氨基酸自动分析仪，6300黄金系统，美国贝可曼公司；

2.2实验动物

2.2.1豚鼠英国种封闭群，普通级，健康，雌雄均可，体重250～350g，试验前及试验后的观察期内，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的动物不得重复利用。

由

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第三军医大学实验动物中心提供。

2.2.2小鼠昆明（KM）小鼠，普通级，健康，6～8周龄，18～22g，合格证号：

310101014，由第三军医大学实验动物中心提供。

2.3样品与试剂

市售猪皮；NIH3T3细胞，L929细胞，由第三军医大学免疫教研室提供；Ⅰ型胶原蛋白对照品，Sigma公司；胃蛋白酶（1：

2500），Sigma公司；胰蛋白酶，Sigma公司；甲醇，Merck公司；羟脯氨酸对照品，南京建成生物工程研究所；DMEM培养基干粉，美国GIBCO公司；小牛血清，兰州民海生物工程公司；丙烯酰胺，Tianjin,H&Y.Bio,Co;Ltd；甲叉双丙烯酰胺，Tianjin,H&Y.Bio,Co;Ltd；TEMED，PromegaCorporation;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；MTT，Sigma公司；DMSO，上海生工有限公司；分子量蛋白Marker，上海生物化学研究所；MDA活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；GSH活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯。

2.4常用工作液

D-Hank’s溶液：

将NaCl8.0g，KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，

Na2HPO4.7H2O0.06g，酚红0.02g，加ddH2O至1000ml溶解，0.07Mpa高压灭菌15min。

双抗储备液：

将青霉素100万单位，链霉素100万单位溶于10mlddH2O，

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即为每毫升含青霉素10万单位，链霉素10万单位的双抗储备液，-20OC保存。

DMEM培养液：

DMEM培养基干粉10g，双抗储备液1ml,NaHCO32.0g，用三蒸水溶解，定容至1000ml。

溶液用5.6%NaHCO3调pH至7.2左右，不锈钢滤器除菌分装，此为不完全DMEM培养液，加入20%小牛血清后为完全DMEM培养液，-20C保存。

胰蛋白酶液：

0.25g胰蛋白酶粉末溶于100ml的PBS中，将即为0.25%胰蛋白酶液。

丙烯酰胺单体贮液：

将14.55g丙烯酰胺和0.45g甲叉双丙烯酰胺溶解于40ml的ddH2O中，搅拌直到溶液变成透明，再加ddH2O至50ml，过滤，装入棕色瓶，4OC可保存一个月。

浓缩胶缓冲液贮液（1mol/LTris-HCL，pH6.8）：

将6.06gTris溶解在40ml的ddH2O中，用4mol/LHCL调节pH至6.8，再加ddH2O至50ml，4C保存。

分离胶缓冲液贮液（1.5mol/LTris-HCL，pH8.8）：

将9.08gT