Menke体外产气法Word格式.docx

1、用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。吸取微生物培养液 用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。记录初始微生物培养液量 排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在

2、操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。空白对照和标准对照实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养

3、到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。产气量计算 （管子）式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差

4、太大，应考虑重作，检查动物状况）。（四）样品采集测定项目取样时间取样部位取样量重复数处理保存温度VFA实际需要上清液1ml-加入0.2ml 8.2%偏磷酸，20000g离心10min4NH3-N24或48h混合液5ml-20MCP24ml附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O ;MnCl2.4H2O ;CoCl2.6H2O ;FeCl3.6H2O ;加蒸馏水至100mlB、缓冲液：NH4HCO3 ;NaHCO3 ;加蒸馏水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O KH2PO4 MgSO4.7H2O D、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100

5、ml蒸馏水E、还原剂溶液（现用现配）：1M NaOH 4.0ml Na22O 625mg 加蒸馏水95ml附表2：人工唾液配制表（1000ml）顺 序原 液体积（ml）1蒸馏水2微量元素溶液（A液）3缓冲液（B液）4常量元素溶液（C液）50.1%刃天青溶液（D液）6还原剂溶液（E液）嘌呤法测定体外微生物蛋白产量（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1、试验试剂A磷酸二氢铵23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水，定容至1000mlBpH=2的蒸馏水在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2C硝酸银准确称取硝酸银，溶解于15ml蒸馏水中，待完全溶解后定容至25ml。溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光

6、的黑纸D盐酸用蒸馏水稀释10ml盐酸（37%）至240mlE用蒸馏水稀释100ml 磷酸二氢铵至700mlF85%磷酸G高氯酸用蒸馏水稀释10ml高氯酸（70%，12M）至200ml2、测定步骤A酵母RNA标准曲线的制作: 分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中，并加入2ml HClO4，于90 - 95水浴1小时，冷却； 再分别加入6ml NH4H2PO4，于90 - 95水浴15min，冷却后在3000g，4条件下离心10min； 取上清液，向上清夜中加入6ml NH4H2PO4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH为23（一般需85%磷酸25l）； 取调整pH

7、值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml AgNO3，混合，于5条件下避光、过夜； 过夜后于3000g，4条件下离心10min，弃上清液；用4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g，4条件下离心10min，弃上清液； 向沉淀中加入5ml HCl 溶液，混匀，在90 - 95条件下水浴30min后，以3000g离心10min； 上清液用 HCl稀释40倍后，以 HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值作出标准曲线。B培养液中微生物蛋白质的测定: 取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管，在20000g，4条件下离心20min；弃上清液后加入2.104ml HCl

8、O4，于90 95水浴1小时，冷却； 按照制作标准曲线的步骤-操作； 以 HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值； 根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：其中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA 含氮量为10%。浙江大学奶业科学研究所比色法测定培养液氨态氮浓度1 试验试剂盐酸溶液将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000ml14%水杨酸钠溶液称取14g水杨酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100ml氢氧化钠溶液氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100mlD液称取亚硝基铁氰化钠溶解于100ml 14%水杨酸钠溶液中E液量取2ml次氯酸钠溶液（商品名安替福明，含活性氯5

9、.2%），混于100ml 氢氧化钠溶液中摇匀2 测定步骤A、氨氮标准系列溶液制备 准确称量氯化铵，用盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱中可存放数月。 取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。含氮量为10mg/100ml。 取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用盐酸定容。这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。B、比色与计算 准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分

10、钟后比色。波长700nm，的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。 用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。 样品处理：取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml 盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。比色操作同：准确量取各溶液0.4 ml 置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定1 混标制备按

11、表1或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。表1 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （umol / ml）乙酸10204080160320丙酸81632丁酸表2 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （ul / ml）0.571 1.143 2.285 4.570 9.140 18.280 0.075 0.149 0.299 0.598 1.196 2.390 0.092 0.184 0.367 0.735 1.470 2.939 2 上机测定色谱柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30mm200220采用程序升温，80持续1min后，以15/min升温至170后维

12、持载气及流速载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/minH2流量40ml/min，空气流量400ml/min2l发酵气体中甲烷含量的测定（一）标准曲线建立用10l的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。由于在测定发酵气体时取样量是20l的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。（二）上机条件100120柱温80载气为高纯氮，压力为179.5kpa，总流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹扫流量3ml/min，循环

13、流量30ml/min检测室气体流速进样量20压力读取式体外产气法（RPT系统）产气瓶产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；1:9的瘤胃液与人工唾液；压力传感器；PC（二）操作流程图（三）试剂配制及具体操作1、试验前准备称量样品 产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要量取瓶子体积）；加入磁力棒；准确称取待测样品一般约750mg（DM，适用0.5-1.5mgDM），置于体外产气瓶底部。体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml，瘤胃液10ml，依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；配

14、制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E液，现用现配，见附表1）。分装人工唾液 不间断地将CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或产气管吸取人工唾液90ml，注入称有样品的产气瓶，并用CO2饱和（可通过三通管完成两路CO2的同时输入）。盖紧橡胶塞后，39恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。其它 2、正式试验，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；回到实验室后，将收集瓶置于水浴

15、锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于39恒温箱中培养。实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于培养箱的不

16、同位置。记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。要求：使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）产气量计算 （瓶子）式中，GPt为样品在t时间段的产气量（ml）；Pt为t时间段读取的压力（mPa）；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压（mPa）；W为样品干物质重。产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。瘤胃发酵样品制备 培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39水浴中操作;取混合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁

17、力搅拌机上操作。重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。Cysteine HCl 625mg 蒸馏水95ml 1M NaOH 4.0ml Na22O 625mg 瘤胃液脂肪酸测定1、样品处理. 取1ml样品于带盖的水解管，加入0.67ml 5M NaOH和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N2；. 85水浴30min，冷却至室温后，加入0.67ml HCl, 使溶液pH低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH计检测；. 加入1ml 2mg/ml 的内标C17：0；. 加入2.5ml氯仿/甲醇（2: 1,v/v）后，涡旋2min；. 将样品在2000g

18、下离心10min；. 移去上层甲醇/水层，轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移；. 通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管；. 用氮气将样品吹干；. 用1.0ml正己烷悬浮后，简单涡旋；. 2000 rpm下离心10min，样品-20冷冻保存。2、上机条件260270采用程序升温，140持续5min后，以4/min升温至240后维持20min载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，线速度：/sec，分流比100，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min产气管，2l；产气瓶4Real-time PCR测定瘤胃微生物数量一、样

19、品采集In vitro实验终止时，若分析混合微生物，可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管（也可直接用灭菌过的含0.3 g 和 锆珠的2ml 螺口管） -80度保存待用。若要分别分析固、液相微生物时，将混合培养液过40um尼龙袋，滤液于4度500g 离心10，上清用于液体微生物DNA提取。尼龙袋于39度灭菌水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份，-80度保存用于固相微生物DNA的提取。In Sacco 方法与此相似。二、总DNA的提取1 试验材料：1.5 mL EP管、螺口管、锆珠、1 mL、 200uL、20ul枪头（均需灭菌）、涡旋器、高速离心机等。2 所需试剂：NaOH、Tris碱、EDTA

20、二钠、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。3.溶液配制方法：试剂方法10 M NaOH称取40 g NaOH，加到100 mL水中。无需除菌。5 M NaCl称取29.22 g NaCl，加水溶解定容至100mL。1 M，pH 8.0 Tris-HCl称取12.114 g Tris碱，加80 mL水，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至100 mL。0.5 M，pH 8.0 EDTA将18.61 g EDTA-Na.加入80 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用10 N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100 mL。TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM ED

21、TA，pH 8.0）吸取1 mL 1M的Tris-HCl和0.2 mL 0.5 M的EDTA，加水定容至100 mL。TN150（10 mM Tris-HCl;150 mM NaCl，pH 8.0）1ml 1M的Tris-HCl和3ml 5M NaCl, 加水定容至100ml。Tris 饱和酚 （pH8.0）购买H24：1的氯仿异戊醇240 mL氯仿+10mL异戊醇I无水乙醇-20度保存。J70%乙醇70 mL无水乙醇加30 mL水-20度保存。4 提取步骤：液相微生物：冰上解冻样品后于4度20000g离心5min，弃上清液。加入1 mL TN150悬浮沉淀，再加150 L的Tris饱和酚，B

22、ead-beater匀浆（4600g，2min），冰上两分钟冷却，重复三次。固相微生物：称取 固体培养物于2ml螺口管，再称 和 灭菌过的锆珠。加入1 mL TN150，150 L的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上冷却两分钟，重复三次。以下步骤相同（2）加入150L氯仿异戊醇，涡旋混匀。20000g离心5 min，上清液转至已1.5 mL EP管中。（3）加入150 L氯仿异戊醇和150 L Tris饱和酚，涡旋混匀1 min，10000g 离心1min，上清液转至1.5 mL EP管中。（4）重复上述步骤直至水相和有机相之间的界面清晰为止（一般需3-5

23、次）。上清液转至1.5 mL EP管中。（5） 加入300 L氯仿异戊醇，涡旋混匀1 min。10000g 离心1min，准确量取上清液转至1.5 mL EP管中。（6） 加入2倍上清体积的冷无水乙醇及1/10倍上清体积的5 M NaCl，涡旋混匀，-20 C沉淀DNA 2小时（或 30min以上）。10000g 离心10 min，弃上清。（7） 加入500 L 70冷乙醇洗涤沉淀，10000g 离心5 min，弃上清，重复三次，风干沉淀。（8） 加入50 -100 L TE缓冲液溶解DNA。提取的DNA部分用于紫外分光光度计测OD值，其余-20 C保存。（9） DNA质量检测：紫外分光光度计测OD值浓度计算：DNA（ngul）OD26050稀释倍数纯度：OD260OD280 为