Menke体外产气法Word格式.docx
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用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；
回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；
用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。
吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。
记录初始微生物培养液量排气过程：
将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；
摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；
读数：
将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。
排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。
空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。
为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。
整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；
精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。
如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。
产气量计算
（管子）
式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；
Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；
V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；
W为样品干物质重（mg）；
GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。
（四）样品采集
测定项目
取样时间
取样部位
取样量
重复数
处理
保存温度
VFA
实际需要
上清液
1ml
-
加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g离心10min
4℃
NH3-N
24或48h
混合液
5ml
-20℃
MCP
24ml
附表1：
人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液：
CaCl2.2H2O;
MnCl2.4H2O;
CoCl2.6H2O;
FeCl3.6H2O;
加蒸馏水至100ml
B、缓冲液：
NH4HCO3;
NaHCO3;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液：
Na2HPO4.12H2O
KH2PO4
MgSO4.7H2O
D、0.1%刃天青溶液：
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
E、还原剂溶液（现用现配）：
1MNaOH4.0mlNa22O625mg加蒸馏水95ml
附表2：
人工唾液配制表（1000ml）
顺序
原液
体积（ml）
1
蒸馏水
2
微量元素溶液（A液）
3
缓冲液（B液）
4
常量元素溶液（C液）
5
0.1%刃天青溶液（D液）
6
还原剂溶液（E液）
嘌呤法测定体外微生物蛋白产量
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1、试验试剂
A
磷酸二氢铵
23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水，定容至1000ml
B
pH=2的蒸馏水
在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2
C
硝酸银
准确称取硝酸银，溶解于15ml蒸馏水中，待完全溶解后定容至25ml。
溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑纸
D
盐酸
用蒸馏水稀释10ml盐酸（37%）至240ml
E
用蒸馏水稀释100ml磷酸二氢铵至700ml
F
85%磷酸
G
高氯酸
用蒸馏水稀释10ml高氯酸（70%，12M）至200ml
2、测定步骤
A．酵母RNA标准曲线的制作:
①分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中，并加入2mlHClO4，于90-95℃水浴1小时，冷却；
②再分别加入6mlNH4H2PO4，于90-95℃水浴15min，冷却后在3000g，4℃条件下离心10min；
③取上清液，向上清夜中加入6mlNH4H2PO4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH为2–3（一般需85%磷酸25µ
l）；
④取调整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2mlAgNO3，混合，于5℃条件下避光、过夜；
⑤过夜后于3000g，4℃条件下离心10min，弃上清液；
用4.5mlpH=2的蒸馏水冲洗沉淀；
再于3000g，4℃条件下离心10min，弃上清液；
⑥向沉淀中加入5mlHCl溶液，混匀，在90-95℃条件下水浴30min后，以3000g离心10min；
⑦上清液用HCl稀释40倍后，以HCl溶液作参比，在260nm下比色，根据光密度值作出标准曲线。
B．培养液中微生物蛋白质的测定:
①取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管，在20000g，4℃条件下离心20min；
弃上清液后加入2.104mlHClO4，于90–95℃水浴1小时，冷却；
②按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作；
③以HCl溶液作参比，在260nm下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值；
④根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：
其中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA含氮量为10%。
浙江大学奶业科学研究所
比色法测定培养液氨态氮浓度
1试验试剂
盐酸溶液
将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000ml
14%水杨酸钠溶液
称取14g水杨酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100ml
氢氧化钠溶液
氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100ml
D液
称取亚硝基铁氰化钠溶解于100ml14%水杨酸钠溶液中
E液
量取2ml次氯酸钠溶液（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml氢氧化钠溶液中摇匀
2测定步骤
A、氨氮标准系列溶液制备
①准确称量氯化铵，用盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱中可存放数月。
②取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。
含氮量为10mg/100ml。
③取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用盐酸定容。
这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。
B、比色与计算
①准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。
波长700nm，的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。
记录各消光值。
②用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。
③样品处理：
取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。
比色操作同：
准确量取各溶液0.4ml置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。
把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。
体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定
1混标制备
按表1或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。
表1乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制（umol/ml）
乙酸
10
20
40
80
160
320
丙酸
8
16
32
丁酸
表2乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制（ul/ml）
0.571
1.143
2.285
4.570
9.140
18.280
0.075
0.149
0.299
0.598
1.196
2.390
0.092
0.184
0.367
0.735
1.470
2.939
2上机测定
色谱柱
HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×
×
µ
m
200℃
220℃
采用程序升温，80℃持续1min后，以15℃/min升温至170℃后维持
载气及流速
载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min
H2流量40ml/min，空气流量400ml/min
2µ
l
发酵气体中甲烷含量的测定
（一）标准曲线建立
用10µ
l的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。
由于在测定发酵气体时取样量是20µ
l的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。
（二）上机条件
100℃
120℃
柱温
80℃
载气为高纯氮，压力为179.5kpa，总流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min
检测室气体流速
进样量
20µ
压力读取式体外产气法（RPT系统）——产气瓶
产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；
1:
9的瘤胃液与人工唾液；
压力传感器；
PC
（二）操作流程图
（三）试剂配制及具体操作
1、试验前准备
称量样品
产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要量取瓶子体积）；
加入磁力棒；
准确称取待测样品一般约750mg（DM，适用0.5-1.5mgDM），置于体外产气瓶底部。
体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml，瘤胃液10ml，依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；
配制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E液，现用现配，见附表1）。
分装人工唾液不间断地将CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或产气管吸取人工唾液90ml，注入称有样品的产气瓶，并用CO2饱和（可通过三通管完成两路CO2的同时输入）。
盖紧橡胶塞后，39±
℃恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。
其它
2、正式试验
℃，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；
用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；
回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；
将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；
用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于39±
℃恒温箱中培养。
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。
空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。
为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于培养箱的不同位置。
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。
要求：
使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）
产气量计算
（瓶子）
式中，GPt为样品在t时间段的产气量（ml）；
Pt为t时间段读取的压力（mPa）；
V0为瓶子体积；
101.3为标准大气压（mPa）；
W为样品干物质重。
产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。
瘤胃发酵样品制备
培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39℃水浴中操作;
取混合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁力搅拌机上操作。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。
CysteineHCl625mg蒸馏水95ml1MNaOH4.0mlNa22O625mg
瘤胃液脂肪酸测定
1、样品处理
.取1ml样品于带盖的水解管，加入0.67ml5MNaOH和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N2；
.85℃水浴30min，冷却至室温后，加入0.67mlHCl,使溶液pH低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH计检测；
.加入1ml2mg/ml的内标C17：
0；
.加入2.5ml氯仿/甲醇（2:
1,v/v）后，涡旋2min；
.将样品在2000g下离心10min；
.移去上层甲醇/水层，轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移；
.通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管；
.用氮气将样品吹干；
.用1.0ml正己烷悬浮后，简单涡旋；
.2000rpm下离心10min，样品-20℃冷冻保存。
2、上机条件
260℃
270℃
采用程序升温，140℃持续5min后，以4℃/min升温至240℃后维持20min
载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，线速度：
/sec，分流比100，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min
产气管，2µ
l；
产气瓶4µ
Real-timePCR测定瘤胃微生物数量
一、样品采集
Invitro实验终止时，若分析混合微生物，可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管（也可直接用灭菌过的含0.3g和锆珠的2ml螺口管）-80度保存待用。
若要分别分析固、液相微生物时，将混合培养液过40um尼龙袋，滤液于4度500⨯g离心10，上清用于液体微生物DNA提取。
尼龙袋于39度灭菌水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份，-80度保存用于固相微生物DNA的提取。
InSacco方法与此相似。
二、总DNA的提取
1试验材料：
1.5mLEP管、螺口管、锆珠、1mL、200uL、20ul枪头（均需灭菌）、涡旋器、高速离心机等。
2所需试剂：
NaOH、Tris碱、EDTA二钠、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。
3.溶液配制方法：
试剂
方法
10MNaOH
称取40gNaOH，加到100mL水中。
无需除菌。
5MNaCl
称取29.22gNaCl，加水溶解定容至100mL。
1M，pH8.0Tris-HCl
称取12.114gTris碱，加80mL水，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至100mL。
0.5M，pH8.0EDTA
将18.61gEDTA-Na.加入80mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
用10N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL。
TE缓冲液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，
pH8.0）
吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA，加水定容至100mL。
TN150（10mMTris-HCl;
150mMNaCl，pH8.0）
1ml1M的Tris-HCl和3ml5MNaCl,加水定容至100ml。
Tris饱和酚（pH8.0）
购买
H
24：
1的氯仿∕异戊醇
240mL氯仿+10mL异戊醇
I
无水乙醇
-20度保存。
J
70%乙醇
70mL无水乙醇加30mL水-20度保存。
4提取步骤：
⑴液相微生物：
冰上解冻样品后于4度20000g离心5min，弃上清液。
加入1mLTN150悬浮沉淀，再加150µ
L的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上两分钟冷却，重复三次。
固相微生物：
称取固体培养物于2ml螺口管，再称和灭菌过的锆珠。
加入1mLTN150，150µ
L的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上冷却两分钟，重复三次。
以下步骤相同
（2）加入150µ
L氯仿∕异戊醇，涡旋混匀。
20000g离心5min，上清液转至已1.5mLEP管中。
（3）加入150µ
L氯仿∕异戊醇和150µ
LTris饱和酚，涡旋混匀1min，10000g离心1min，上清液转至1.5mLEP管中。
（4）重复上述步骤直至水相和有机相之间的界面清晰为止（一般需3-5次）。
上清液转至1.5mLEP管中。
（5）加入300µ
L氯仿∕异戊醇，涡旋混匀1min。
10000g离心1min，准确量取上清液转至1.5mLEP管中。
（6）加入2倍上清体积的冷无水乙醇及1/10倍上清体积的5MNaCl，涡旋混匀，-20º
C沉淀DNA2小时（或>
30min以上）。
10000g离心10min，弃上清。
（7）加入500µ
L70％冷乙醇洗涤沉淀，10000g离心5min，弃上清，重复三次，风干沉淀。
（8）加入50-100µ
LTE缓冲液溶解DNA。
提取的DNA部分用于紫外分光光度计测OD值，其余-20º
C保存。
（9）DNA质量检测：
紫外分光光度计测OD值
浓度计算：
DNA（ng∕ul）＝OD260×
50×
稀释倍数
纯度：
OD260∕OD280为
升级会员 