菌体浓度对发酵的影响.docx

1、菌体浓度对发酵的影响一、菌体浓度对发酵的影响及控制菌体（细胞）浓度(cellconcentration)是指单位体积培养液中菌体的含量。无论在科学研究上.还是在工业发酵控制上.它都是一个重要的参数。菌浓的大小.在一定条件下.不仅反映菌体细胞的多少.而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。在发酵动力学研究中.需要利用菌浓参数来算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数.以研究它们之间的相互关系.探明其动力学规律.所以菌浓仍是一个基本参数。菌浓的大小与菌体生长速率有密切关系。比生长速率大的菌体.菌浓增长也迅速.反之就缓慢。而菌体的生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性有关.不同种

2、类的微生物的生长速率是不一样的。它的大小取决于细胞结构的复杂性和生长机制.细胞结构越复杂.分裂所需的时间就越长。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为45min、90min、3h和6h左右.这说明各类微生物增殖速率的差异。菌体的增长还与营养物质和环境条件有密切关系。营养物质包括各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。按照Monod方程式来看.生长速率取决于基质的浓度(各种碳源的基质饱和系数Ks在110mgL之间).当基质浓度c(S)10Ks时.比生长速率就接近最大值。所以营养物质均存在一个上限浓度.在此限度以内.菌体比生长速率则随基质浓度增加而增加.但超过此上限.基质浓度继续增加.反而会引

3、起生长速率下降。这种效应通常称为基质抑制作用。这可能是由于高浓度基质形成高渗透压.引起细胞脱水而抑制生长。这种作用还包括某些化合物(如甲醇、苯酚等)对一些关键酶的抑制.或使细胞结构成分发生变化。一些营养物质的上限浓度(gL)如下：葡萄糖100、NH4+5、PO43-10。在实际生产中.常用丰富培养基.促使菌体迅速繁殖.菌浓增大.引起溶氧下降。所以.在微生物发酵的研究和控制中.营养条件(含溶氧)的控制至关重要。影响菌体生长的环境条件有温度、pH值、渗透压和水分活度等因素。菌浓的大小.对发酵产物的得率有着重要的影响。在适当的比生长速率下.发酵产物的产率与菌浓成正比关系.即P=QPmc(X)式中P发

4、酵产物的产率(产物最大生成速率或生产率).g(Lh)；QPm产物最大比生成速率.h-1；c(X)菌体浓度.gL。菌浓愈大.产物的产量也愈大.如氨基酸、维生素这类初级代谢产物的发酵就是如此。而对抗生素这类次级代谢产物来说.控制菌体的比生长速率比临略高一点的水平.达到最适菌浓即c(X)临.菌体的生产率最高。但是菌浓过高.则会产生其他的影响.营养物质消耗过快.培养液的营养成分发生明显的改变.有毒物质的积累.就可能改变菌体的代谢途径.特别是对培养液中的溶氧.影响尤为明显。菌浓增加而引起的溶氧下降.会对发酵产生各种影响。早期酵母发酵.会出现代谢途径改变、酵母生长停滞、产生乙醇的现象；抗生素发酵中.也受溶

5、氧限制.使产量降低。如图7-7.为了获得最高的生产率.需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度.也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度.即临界菌体浓度c(X)临。菌体超过此浓度.抗生素的比生成速率和体积产率都会迅速下降。图7-7摄氧速率OUR曲线与传氧速率OTR曲线关系示意图发酵过程中除要有合适的菌浓外.还需要设法控制菌浓在合适的范围内。菌体的生长速率.在一定的培养条件下.主要受营养基质浓度的影响.所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。首先要确定基础培养基配方中有适当的配比.避免产生过浓(或过稀)的菌体量。然后通过中间补料来控制.如当菌体

6、生长缓慢、菌浓太稀时.则可补加一部分磷酸盐.促进生长.提高菌浓；但补加过多.则会使菌体过分生长.超过c(X)临.对产物合成产生抑制作用。在生产上.还可利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量.以控制菌体的生长和浓度。总之.可根据不同的菌种和产品.采用不同的方法来达到最适的菌浓。 基质对发酵影响及其控制基质即培养微生物的营养物质。对于发酵控制来说.基质是生产菌代谢的物质基础.既涉及菌体的生长繁殖.又涉及代谢产物的形成。因此基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切的关系。所以选择适当的基质和控制适当的浓度.是提高代谢产物产量的重要方法。据Monod方程.在分批发酵中菌体比生长速度是基质浓度的函数

7、。在c(S)1.1.糖经EMP生成乙醇。不同基质.菌的RQ不同。E.coli以延胡索酸为基质.RQ=1.44；以丙酮酸为基质.RQ=1.26；以琥珀酸为基质.RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖为基质.RQ分别为1.02和1.00。在抗生素发酵中.由于存在菌体生长、维持及产物形成的不同阶段.其RQ值也不一样。青霉素发酵的理论呼吸商：菌体生长0.909.菌体维持1.青霉素合成4。从上述情况看.发酵早期.主要是菌生长.RQ1；过渡期菌体维持其生命活动.产物逐渐形成.基质葡萄糖的代谢不仅仅用于菌体生长.RQ比生长期略有增加。产物形成对RQ的影响较为明显.如产物还原性比基质大.RQ增加；产物氧化性比基质大.

8、RQ就减少。其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。实际生产中测定的RQ值明显低于理论值.说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和除葡萄糖以外的其他碳源。如发酵过程中加入消泡剂.由于它具有不饱和性和还原性.使RQ值低于葡萄糖为惟一碳源时RQ值。如试验结果表明.青霉素发酵中.RQ为0.50.7之间.且随葡萄糖与消泡剂加入量之比而波动。RQ是碳-能源代谢情况的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的情况下.碳-能源趋向于完全氧化.RQ应达到完全氧化的理论值.见表7-1。如果碳-能源过量及供氧不足.可能出现碳-能源不完全氧化的情况.从而造成RQ异常。表7-1一些碳-能源基质的理论呼吸商四、C

9、O2浓度的控制 CO2在发酵液中的浓度变化不像溶氧那样.没有一定的规律。它的大小受到许多因素的影响.如菌体的呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度和外界压力大小等因素。设备规模大小也有影响.由于CO2的溶解度随压力增加而增大.大发酵罐中的发酵液的静压可达0.1MPa以上.又处在正压发酵.致使罐底部压强可达0.15MPa。因此CO2浓度增大.如不提高搅拌转数.CO2就不易排出.在罐底形成碳酸.进而影响菌体的呼吸和产物的合成。为了控制CO2的不良影响.必须考虑CO2在培养液中的溶解度、温度和通气情况。在发酵过程中.如遇到泡沫上升而引起“逃液”时.采用增加罐压的方法来消泡。但这样会增加CO2的溶解

10、度.对菌体生长是不利的。CO2浓度的控制应随它对发酵的影响而定。如果CO2对产物合成有抑制作用.则应设法降低其浓度；若有促进作用.则应提高其浓度。通气和搅拌速率的大小.不但能调节发酵液中的溶解氧.还能调节CO2的溶解度.在发酵罐中不断通入空气.既可保持溶氧在临界点以上.又可随废气排出所产生的CO2.使之低于能产生抑制作用的浓度。因而通气搅拌也是控制CO2浓度的一种方法.降低通气量和搅拌速率.有利于增加CO2在发酵液中的浓度；反之就会减小CO2浓度。在3m3发酵罐中进行四环素发酵试验.发酵40h以前.通气量减小到75m3h.搅拌为80rmin.以此来提高CO2的浓度；40h以后.通气量和搅拌分别

11、提高到110m3h和140rmin.以降低CO2浓度.使四环素产量提高2530。CO2形成的碳酸.还可用碱来中和.但不能用CaCO3。罐压的调节.也影响CO2的浓度.对菌体代谢和其他参数也产生影响。CO2的产生与补料工艺控制密切相关.如在青霉素发酵中.补糖会增加CO2的浓度和降低培养液的pH值。因为补加的糖用于菌体生长、菌体维持和青霉素合成三方面.它们都产生CO2.使CO2量增加。溶解的CO2和代谢产生的有机酸.又使培养液pH值下降。因此.补糖、CO2、pH值三者具有相关性.被用于青霉素补料工艺的控制参数.其中排气中的CO2量的变化比pH值变化更为敏感.所以.采用测定CRR作为控制补糖速率参数

12、。第七节补料的控制 补料分批发酵(fed-batchculture.简称FBC).又称半连续培养或半连续发酵.是指在分批发酵过程中.间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法.是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式.是一种控制发酵的好方法.现已广泛用于发酵工业。同传统的分批发酵相比.FBC具有以下的优点：可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响.改善发酵液流变学的性质；可用作为控制细胞质量的手段.以提高发芽孢子的比例；可作为理论研究的手段.为自动控制和最优控制提供实验基础。同连续发酵相比.FBC不需要严格

13、的无菌条件.产生菌也不会产生老化和变异等问题.适用范围也比连续发酵广泛。由于FBC有这些优点.现已被广泛地用于微生物发酵生产和研究中。如已应用于酶类、抗生素类、激素药物类、氨基酸和维生素等十余类几十种工业产品中。一、FBC的作用 FBC的操作比较简单.效果也是比较明显的。但是这种控制方法是建立在什么理论基础上.对微生物的生理和产物的合成又能产生什么作用.我们应该有个基本了解。已有研究结果表明.FBC对微生物发酵有下列几个基本作用。可以控制抑制性底物的浓度在许多发酵过程中.微生物的生长是受到基质浓度的影响。要想得到高密度的生物量.需要投入几倍的基质。按monod方程.当营养底物浓度增加到一定量时

14、.生长就显示饱和型动力学.再增加底物浓度.就可能产生一种基质抑制区.停滞期延长.菌体比生长速率减小.菌浓下降等。所以高浓度营养物对大多数微生物生长是不利的。抑制微生物生长有多种原因：有的基质过浓使渗透压过高.细胞因脱水而死亡；高浓度基质能使微生物细胞热致死(themaldeath).如乙醇浓度达10时.就可使酵母细胞热致死；有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用.如高浓度苯酚(35)可凝固蛋白；高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。在微生物发酵中.有的基质又是合成产物必需的前体物质.浓度过高.就会影响菌体代谢或产生毒性.使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分别是青

15、霉素、红霉素的前体物质.浓度过大.就会产生毒性.使抗生素产量减少。有的是受底物溶解度小的限制.达不到应有的浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中.因它们的溶解度小.使基质的浓度低.造成转化率不高。为了在分批发酵中.获得高浓度菌体或产物.必须在基础培养基中防止有过高浓度的基质或抑制性底物.采用FBC方式.就可以控制适当的基质浓度.解除其抑制作用.又可得到高浓度的产物。 可以解除或减弱分解代谢物的阻遏在微生物合成初级或次级代谢产物中.有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏.特别是葡萄糖.它能够阻抑多种酶或产物的合成.如纤维素酶、赤霉素、青霉素等。已知这种阻遏作用不是葡萄糖的直接作用.而是由葡萄糖的

16、分解代谢产物所引起的。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度.就可解除酶或其产物的阻遏.提高产物产量。如缓慢流加葡萄糖.纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02水平.赤霉素浓度可达905mgL；采用滴加葡萄糖的技术.可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中.也采用该技术来提高产量。可以使发酵过程最佳化分批发酵动力学的研究.阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术.就可以使菌种保持在最大生产力的状态。随着FBC补料方式的不断改进.为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。随着计算机、传感器等的发展和应用.已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。二、补料的方式及控制 补料方式有很多种情况.有连续流加、不连续流加或多周期流加。每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。从补加培养基的成分来分.又可分为单组分补料和多组分补料。流加操作控制系统又分为有反馈控制和无反馈控制两类。这两类的数学模型在理论上没有什么差别。反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器三个单