在正常的情况下.可达到菌体最大比生长速率.然而.由于代谢产物及其基质过浓.而导致抑制作用.出现菌体比生长速率下降的趋势。
当葡萄糖浓度低于100～150g／L.不出现抑制作用；当葡萄糖浓度高于350～500g／L.多数微生物不能生长.细胞出现脱水现象。
就产物的形成来说.培养基过于丰富.有时会使菌体生长过旺.黏度增大.传质差.菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境.即用于非生产的能量大量增加。
所以.在分批发酵中.控制合适的基质浓度不但对菌体的生长有利.对产物的形成也有益处。
这里要着重说明碳源、氮源和无机盐等对发酵的影响及其控制。
⒈碳源对发酵的影响及其控制
碳源.按菌体利用快慢而言.分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。
前者（如葡萄糖）能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量.并产生分解代谢产物（如丙酮酸等）.因此有利于菌体生长.但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；后者多数为聚合物（也有例外）.为菌体缓慢利用.有利于延长代谢产物的合成.特别有利于延长抗生素的生产期.也为许多微生物药物的发酵所采用。
例如.乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油及半乳糖分别是青霉素、头孢菌素C、盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。
因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。
在青霉素的早期研究中.就认识到了碳源的重要性。
在迅速利用的葡萄糖培养基中.菌体生长良好.但青霉素合成量很少；相反.在缓慢利用的乳糖培养基中.青霉素的产量明显增加。
糖对青霉素生物合成的影响见图7-8。
由图可见.糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素。
所以缓慢滴加葡萄糖以代替乳糖.仍然可以得到良好的结果。
这就说明乳糖之所以是青霉素发酵的良好碳源.并不是它起着前体作用.只是它被缓慢利用的速度恰好适合青霉素合成的要求.其他抗生素发酵也有类似情况。
在初级代谢中也有类似情况.如葡萄糖完全阻遏嗜热脂肪芽孢杆菌产生胞外生物素（属同效维生素.vitamer.化学构造及生理作用与天然维生素相类似的化合物）的合成。
因此.控制使用能产生阻遏作用的迅速利用的碳源是非常重要的。
在工业上.发酵培养基中常采用含迅速利用和缓慢利用的混合碳源.就是根据这个原理来控制菌体的生长和产物的合成。
图7-8糖对青霉素生物合成的影响试验
碳源的浓度也有明显的影响。
由于营养过于丰富所引起的菌体异常繁殖.对菌体的代谢、产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响。
若产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大.则产物的合成会受到明显的抑制；反之.仅仅供给维持量的碳源.菌体生长和产物合成就都停止。
所以控制合适的碳源浓度是非常重要的。
如在产黄青霉Wis54-1255发酵中.给以维持量的葡萄糖[其比消耗速率0.022g／（g·h）].菌的比生长速率和青霉素的比生成速率都为零.所以必须供给适量的葡萄糖.方能维持青霉素的合成速率。
因此.控制适当的碳源浓度.对工业发酵是很重要的。
控制碳源的浓度.可采用经验法和动力学法.即在发酵过程中采用中间补料的方法来控制。
这要根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。
动力学方法是要根据菌体的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。
⒉氮源对发酵的影响及其控制
氮源有无机氮源和有机氮源两类。
它们对菌体代谢都能产生明显的影响.不同的种类和不同的浓度都能影响产物合成的方向和产量。
如谷氨酸发酵.当NH4+供应不足时.就促使形成α-酮戊二酸；过量的NH4+.反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。
控制适量的NH4+浓度.才能使谷氨酸产量达到最大。
又如在研究螺旋霉素的生物合成中.发现无机铵盐不利于螺旋霉素的合成.而有机氮源（如鱼粉）则有利于其形成。
氮源像碳源一样.也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。
前者如氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）和玉米浆等；后者如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。
它们各有自己的作用.快速利用的氮源容易被菌体所利用.促进菌体生长.但对某些代谢产物的合成.特别是某些抗生素的合成产生调节作用.影响产量。
如链霉菌的竹桃霉素发酵中.采用促进菌体生长的铵盐浓度.能刺激菌丝生长.但抗生素产量下降。
铵盐还对柱晶白霉素、螺旋霉素、泰洛星等的合成产生调节作用。
缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的生产期、提高产物的产量是有好处的。
但一次投入全量.也容易促进菌体生长和养分过早耗尽.以致菌体过早衰老而自溶.从而缩短产物的生产期。
综上所述.对微生物发酵来说.也要选择适当的氮源和浓度。
发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。
如氨基酸发酵用铵盐（硫酸铵或醋酸铵）和麸皮水解液、玉米浆；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。
但也有使用单一的铵盐或有机氮源（如黄豆饼粉）。
它们被利用的情况与快速利用和慢速利用的碳源情况相似。
为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶.除了基础培养基中的氮源外.还要在发酵过程中补加氮源来控制其浓度。
生产上采用的方法有如下几种。
⑴补加有机氮源根据产生菌的代谢情况.可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源.如酵母粉、玉米浆、尿素等。
如土霉素发酵中.补加酵母粉.可提高发酵单位；青霉素发酵中.后期出现糖利用缓慢、菌浓变稀、pH值下降的现象.补加生理碱性物质的尿素就可改善这种状况并提高发酵单位；氨基酸发酵中.也可补加作为氮源和pH值调节剂的尿素。
⑵补加无机氮源补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。
氨水既可作为无机氮源.又可调节pH值。
在抗生素发酵工业中.通氨是提高发酵产量的有效措施.如与其他条件相配合.有的抗生素的发酵单位可提高50％左右。
但当pH值偏高而又需补氮时.就可补加生理酸性物质的硫酸铵.以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的。
还可补充其他无机氮源.但需根据发酵控制的要求来选择。
⒊磷酸盐对发酵的影响及其控制
磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分.也是合成代谢产物所必需的。
微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol／L.但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol／L.提高到10mmol／L.就明显地抑制其合成。
相比之下.菌体生长所允许的浓度比次级代谢产物合成所允许的浓度就大得多.两者平均相差几十倍至几百倍。
因此控制磷酸盐浓度对微生物次级代谢产物发酵来说是非常重要的。
磷酸盐浓度调节代谢产物合成机制.对于初级代谢产物合成的影响.往往是通过促进菌体生长而间接产生的.对于次级代谢产物来说.机制就比较复杂。
磷酸盐浓度的控制.一般是在基础培养基中采用适当的浓度。
对于初级代谢来说.要求不如次级代谢那么严格。
对抗生素发酵来说.常常是采用生长亚适量（对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量）的磷酸盐浓度。
其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素.即使同一种抗生素发酵.不同地区不同工厂所用的磷酸盐浓度也不一致.甚至相差很大。
因此磷酸盐的最适浓度.必须结合当地的具体条件和使用的原材料进行实验确定。
培养基中的磷含量.还可能因配制方法和灭菌条件不同.引起含量的变化。
据报道.利用金霉素链霉菌949（S.aureofaciens949）进行四环素发酵.菌体生长最适的磷浓度为65～70μg／mL.而四环素合成最适磷浓度为25～30μg／mL。
青霉素发酵.以用0.01％的磷酸二氢钾为好。
在发酵过程中.有时发现代谢缓慢的情况.还可补加磷酸盐。
在四环素发酵中.间歇、微量添加磷酸二氢钾.有利于提高四环素的产量。
除上述主要基质外.还有其他培养基成分影响发酵。
如Cu2+.在以醋酸为碳源的培养基中.能促进谷氨酸产量的提高；Mn2+对芽孢杆菌合成杆菌肽等次级代谢产物具有特殊的作用.必须使用其足够的浓度才能促进杆菌肽的合成等。
总之.发酵过程中.控制基质的种类及其用量是非常重要的.是发酵能否成功的关键.必须根据产生菌的特性和各个产物合成的要求.进行深入细致的研究.方能取得良好的结果。
第六节CO2和呼吸商
二氧化碳（CO2）是微生物的代谢产物.同时.它也是合成产物所需的一种基质。
对微生物生长和发酵具有刺激作用.它是细胞代谢的可贵指标。
有人把细胞量与累积尾气CO2生成关联.把CO2生成作为一种手段.通过碳质量平衡来估算菌体生长速率和细胞量。
溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有抑制和刺激作用.对许多产物的生产菌亦有影响。
一、CO2对菌体生长和产物形成的影响
CO2对菌体的生长有直接作用.引起碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。
大量实验表明.CO2对生产过程具有抑制作用。
当CO2分压为0.008MPa时.青霉素合成速度降低40％；发酵液中溶解CO2浓度为1.6×10-2mol／L时.会严重抑制酵母生长。
当进气口CO2含量占混合气体体积的80％时.酵母活力只达到对照组的80％。
一般以1L／（L·min）的空气流量通气发酵.发酵液中溶解CO2只达到抑制水平的10％。
当微生物生长受到抑制时.也阻碍了基质的异化（或分解代谢）和ATP的生成量.由此而影响产物的合成。
在氨基糖苷类抗生素紫苏霉素（sisomycin）生产中.在300L发酵罐于空气进口通以1％CO2.发现微生物对基质的代谢极慢.菌丝增长速度降低.紫苏霉素的产量比对照组降低33％。
通入2％CO2.紫苏霉素的产量比对比照组降低85％.CO2的含量超过3％.则不产生紫苏霉素。
CO2会影响产黄青霉菌（penicilliumchrysogenum）的形态。
研究者将产黄青霉菌接种到溶解不同CO2浓度的培养基中.发现菌丝形态发生变化。
CO2分压0～8％时.菌丝主要是丝状；CO2分压15％～22％.则膨胀.粗短的菌丝占优势；CO2为0.008MPa时.则出现球状或酵母状细胞.致使青霉素合成受阻.其比生成速率降低40％左右。
CO2对细胞作用机制是怎样的呢？
CO2及HCO3-都会影响细胞膜结构.它们分别作用于细胞膜的不同位点。
CO2主要作用在细胞膜的脂肪核心部位。
HCO3-则影响磷脂.亲水头部带电荷表面及细胞膜表面的蛋白质。
当细胞膜的脂质相中CO2浓度达临界值时.使膜的流动性及表面电荷密度发生变化.这将导致许多基质的膜运输受阻.影响细胞膜的运输效率.使细胞处于“麻醉”状态.细胞生长受到抑制.形态发生改变。
CO2对发酵的影响很难进行估算和优化.估计在大规模发酵中CO2的作用将成为突出的问题。
因发酵罐中CO2的分压是液体深度的函数.10m深的发酵罐在0.101MPa气压下操作.底部CO2分压是顶部CO2分压的2倍。
为了排除CO2的影响.必须考虑CO2在培养液中的溶解度、温度及通气情况。
CO2溶解度大.对菌生长不利。
二、CO2的释放率
分析尾气中CO2的含量.记录培养基体积及通气量的变化.用计算机计算CO2的积累量.与培养基培养菌体的干重比较.得出对数期菌体生长速率与CO2释放率成正比关系（一般空气进口O2占20.85％、CO2占0.03％、惰性气体79.12％）。
如果连续测得排气氧和CO2浓度.可计算出整个发酵过程中CO2的释放率（Carbondioxidereleaseratio.简称CRR）。
式中
——二氧化碳比释放率.mmolCO2／（g干菌体·h）；
c（X）——发酵液中菌体的浓度.g干菌体／L。
三、呼吸商与发酵的关系
发酵过程中菌的耗氧速率OUR可通过热磁氧分析仪或质谱仪测量进气和排气中的氧含量计算而得.并最终计算出呼吸商RQ。
RQ可以反映菌的代谢情况.酵母发酵.RQ=1.糖有氧代谢.仅生成菌体.无产物形成；RQ>1.1.糖经EMP生成乙醇。
不同基质.菌的RQ不同。
E.coli以延胡索酸为基质.RQ=1.44；以丙酮酸为基质.RQ=1.26；以琥珀酸为基质.RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖为基质.RQ分别为1.02和1.00。
在抗生素发酵中.由于存在菌体生长、维持及产物形成的不同阶段.其RQ值也不一样。
青霉素发酵的理论呼吸商：
菌体生长0.909.菌体维持1.青霉素合成4。
从上述情况看.发酵早期.主要是菌生长.RQ<1；过渡期菌体维持其生命活动.产物逐渐形成.基质葡萄糖的代谢不仅仅用于菌体生长.RQ比生长期略有增加。
产物形成对RQ的影响较为明显.如产物还原性比基质大.RQ增加；产物氧化性比基质大.RQ就减少。
其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量。
实际生产中测定的RQ值明显低于理论值.说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和除葡萄糖以外的其他碳源。
如发酵过程中加入消泡剂.由于它具有不饱和性和还原性.使RQ值低于葡萄糖为惟一碳源时RQ值。
如试验结果表明.青霉素发酵中.RQ为0.5～0.7之间.且随葡萄糖与消泡剂加入量之比而波动。
RQ是碳-能源代谢情况的指示值。
在碳-能源限制及供氧充分的情况下.碳-能源趋向于完全氧化.RQ应达到完全氧化的理论值.见表7-1。
如果碳-能源过量及供氧不足.可能出现碳-能源不完全氧化的情况.从而造成RQ异常。
表7-1一些碳-能源基质的理论呼吸商
四、CO2浓度的控制
CO2在发酵液中的浓度变化不像溶氧那样.没有一定的规律。
它的大小受到许多因素的影响.如菌体的呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度和外界压力大小等因素。
设备规模大小也有影响.由于CO2的溶解度随压力增加而增大.大发酵罐中的发酵液的静压可达0.1MPa以上.又处在正压发酵.致使罐底部压强可达0.15MPa。
因此CO2浓度增大.如不提高搅拌转数.CO2就不易排出.在罐底形成碳酸.进而影响菌体的呼吸和产物的合成。
为了控制CO2的不良影响.必须考虑CO2在培养液中的溶解度、温度和通气情况。
在发酵过程中.如遇到泡沫上升而引起“逃液”时.采用增加罐压的方法来消泡。
但这样会增加CO2的溶解度.对菌体生长是不利的。
CO2浓度的控制应随它对发酵的影响而定。
如果CO2对产物合成有抑制作用.则应设法降低其浓度；若有促进作用.则应提高其浓度。
通气和搅拌速率的大小.不但能调节发酵液中的溶解氧.还能调节CO2的溶解度.在发酵罐中不断通入空气.既可保持溶氧在临界点以上.又可随废气排出所产生的CO2.使之低于能产生抑制作用的浓度。
因而通气搅拌也是控制CO2浓度的一种方法.降低通气量和搅拌速率.有利于增加CO2在发酵液中的浓度；反之就会减小CO2浓度。
在3m3发酵罐中进行四环素发酵试验.发酵40h以前.通气量减小到75m3／h.搅拌为80r／min.以此来提高CO2的浓度；40h以后.通气量和搅拌分别提高到110m3／h和140r／min.以降低CO2浓度.使四环素产量提高25％～30％。
CO2形成的碳酸.还可用碱来中和.但不能用CaCO3。
罐压的调节.也影响CO2的浓度.对菌体代谢和其他参数也产生影响。
CO2的产生与补料工艺控制密切相关.如在青霉素发酵中.补糖会增加CO2的浓度和降低培养液的pH值。
因为补加的糖用于菌体生长、菌体维持和青霉素合成三方面.它们都产生CO2.使CO2量增加。
溶解的CO2和代谢产生的有机酸.又使培养液pH值下降。
因此.补糖、CO2、pH值三者具有相关性.被用于青霉素补料工艺的控制参数.其中排气中的CO2量的变化比pH值变化更为敏感.所以.采用测定CRR作为控制补糖速率参数。
第七节补料的控制
补料分批发酵（fed-batchculture.简称FBC）.又称半连续培养或半连续发酵.是指在分批发酵过程中.间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法.是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式.是一种控制发酵的好方法.现已广泛用于发酵工业。
同传统的分批发酵相比.FBC具有以下的优点：
①可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；②可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响.改善发酵液流变学的性质；③可用作为控制细胞质量的手段.以提高发芽孢子的比例；④可作为理论研究的手段.为自动控制和最优控制提供实验基础。
同连续发酵相比.FBC不需要严格的无菌条件.产生菌也不会产生老化和变异等问题.适用范围也比连续发酵广泛。
由于FBC有这些优点.现已被广泛地用于微生物发酵生产和研究中。
如已应用于酶类、抗生素类、激素药物类、氨基酸和维生素等十余类几十种工业产品中。
一、FBC的作用
FBC的操作比较简单.效果也是比较明显的。
但是这种控制方法是建立在什么理论基础上.对微生物的生理和产物的合成又能产生什么作用.我们应该有个基本了解。
已有研究结果表明.FBC对微生物发酵有下列几个基本作用。
⒈可以控制抑制性底物的浓度
在许多发酵过程中.微生物的生长是受到基质浓度的影响。
要想得到高密度的生物量.需要投入几倍的基质。
按monod方程.当营养底物浓度增加到一定量时.生长就显示饱和型动力学.再增加底物浓度.就可能产生一种基质抑制区.停滞期延长.菌体比生长速率减小.菌浓下降等。
所以高浓度营养物对大多数微生物生长是不利的。
抑制微生物生长有多种原因：
①有的基质过浓使渗透压过高.细胞因脱水而死亡；②高浓度基质能使微生物细胞热致死（themaldeath）.如乙醇浓度达10％时.就可使酵母细胞热致死；③有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用.如高浓度苯酚（3％～5％）可凝固蛋白；④高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。
在微生物发酵中.有的基质又是合成产物必需的前体物质.浓度过高.就会影响菌体代谢或产生毒性.使产物产量降低。
如苯乙酸、丙醇（或丙酸）分别是青霉素、红霉素的前体物质.浓度过大.就会产生毒性.使抗生素产量减少。
有的是受底物溶解度小的限制.达不到应有的浓度而影响转化率。
如甾类化合物转化中.因它们的溶解度小.使基质的浓度低.造成转化率不高。
为了在分批发酵中.获得高浓度菌体或产物.必须在基础培养基中防止有过高浓度的基质或抑制性底物.采用FBC方式.就可以控制适当的基质浓度.解除其抑制作用.又可得到高浓度的产物。
⒉可以解除或减弱分解代谢物的阻遏
在微生物合成初级或次级代谢产物中.有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏.特别是葡萄糖.它能够阻抑多种酶或产物的合成.如纤维素酶、赤霉素、青霉素等。
已知这种阻遏作用不是葡萄糖的直接作用.而是由葡萄糖的分解代谢产物所引起的。
通过补料来限制基质葡萄糖的浓度.就可解除酶或其产物的阻遏.提高产物产量。
如缓慢流加葡萄糖.纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02％水平.赤霉素浓度可达905mg／L；采用滴加葡萄糖的技术.可明显提高青霉素的发酵单位等。
这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。
在植物细胞培养中.也采用该技术来提高产量。
⒊可以使发酵过程最佳化
分批发酵动力学的研究.阐明了各个参数之间的相互关系。
利用FBC技术.就可以使菌种保持在最大生产力的状态。
随着FBC补料方式的不断改进.为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。
随着计算机、传感器等的发展和应用.已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。
二、补料的方式及控制
补料方式有很多种情况.有连续流加、不连续流加或多周期流加。
每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。
从补加培养基的成分来分.又可分为单组分补料和多组分补料。
流加操作控制系统又分为有反馈控制和无反馈控制两类。
这两类的数学模型在理论上没有什么差别。
反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器三个单
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