1、实验六、荧光测定实验一、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中,横坐标为波长(或频率),纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱 ,有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长,纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低;也表示用不同波长的光激发材料时,使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变
2、化的曲线。横坐标为时间,纵坐标为发光强度(或相对发光强度)。 二、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后,再经分束器 照到样品表面,样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光,再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端,用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。 注意:选做钨灯光源激发光谱、发射光谱测试的同学应采用天津港东WGY-10型荧光分光光度计。 光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后,照到荧光池中的被测样品上,样品受到该激发光
3、照射后 发出的荧光经发射单色器分光,由光电倍增管转换成相应电信号,再经放大器放大反馈进入A/D转换单元,将模拟电信号转换成相应数字信号,并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。三、样品制备 1. 粉末试样 粉末试样可适当添加不影响光谱特性的粘结剂(也可不添加粘结剂),置于样品台凹槽中,压实、用载玻片碾平,固定到样品座中。 2. 块状试样 块状试样可以直接用双面胶粘结在样品台上,固定到样品座中。 3. 液体试样 液体试样应放入专用的液体样品槽中,固定到样品座中。 四、测试过程RF-5301PC荧光分光光度计测试发射、激发光谱及余辉衰减曲线 先开机:打开Xe灯开关 和 主机开关。开电脑。双击
4、电脑桌面的 “RFPC”程序快捷键 进入测试程序,会出现 初始化界面,仪器依次检测ROM、RAM、EEPROM激发狭缝、发射狭缝、激发单色器、发射单色器和基线,初始化完成后,进入到测试界面。 1. 发射光谱的测试 第一步:参数设置。 点击Configure 设置 / Parameter 参数,进行测试参数设置: (1) 第一行为光谱类型。选择“Emission”发射光谱 (2) 第二行为激发波长。输入激发波长(可以查找数据) (3) 第三行为发光波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长(对于未知样,也可选择可见光全波段400760nm,一般范围:激发波长加二倍狭缝宽二倍激发波长减去二倍狭缝宽)
5、(4) 第四行为记录范围。输入纵坐标的最小和最大显示值 (5) 第五行为扫描速度。由快至慢有6种速度选择 (6) 第七行为狭缝宽度。可分别选择 激发和发射狭缝 宽度,(对于发光较弱的样品,测试时可以适当增大狭缝宽度。) (7) 第八行为测试灵敏度选框。 (8) 第九行为响应时间选框,由快至慢有9种速度选择 (9) 参数设置完成后,点击“OK”。第二步:光谱测试。 点击屏幕右下角“Start”按钮,开始发射光谱测试。测试完成后,屏幕会自动弹出一个保存界面:上栏可输入文件名称,下栏可输入注解,若输入注解,则该注解将会在打印出的报告中显示出来。输入文件名后,点击“Save”保存。 注意:这种保存只是
6、临时保存,关机后将消失。永久保存需使用 File / Save as,选择存储路径和文件夹,点击“Save As”保存。保存后的文件,扩展名是“.SPC”,只能用“RF-5301PC”程序打开。若想将测试结果转换为数据,以利于使用其他软件作图和编辑,需进行数据转换。 第三步:自动寻峰。 对于测试所得的发射光谱,程序能够进行自动寻峰。 步骤是:点击Manipulate 操作 / 选择Peak pick / 鼠标左键点住屏幕下方弹出的窗口,上拉,调整窗口大小,即可读出峰值。 第四步:数据转换。 点击File / Data translation / AscII Export / 则询问转换哪个通道
7、?选择通道后,点击OK,则数据转换过程完成。 转换后的扩展名为“.ASC”的文件自动保存在了C盘 / RFPC 文件夹 / Data 子夹中。 第五步:数据处理。 打开Origin软件,点击工具菜单中的 “导入ASC码文件” 快捷键,按照路径 寻找 我们刚刚转换的 扩展名为“.ASC” 的文件,点击“打开”,则数据被导入。点击屏幕下方的“直线”工具,即可完成作图。调整 横、纵坐标的字号。输入 横、纵坐标名称和单位。数据处理完成后,可直接复制到Word文件中。 2. 激发光谱的测试 第一步:参数设置。 点击Configure 设置 / Parameter 参数,进行测试参数设置: (1) 在光谱
8、类型选框中,选择“Excitation”激发光谱,选择后,下面几行选项随之变化。 (2) 第二行为监测的发光波长。(通常,选择发射光谱的峰值位置作为监测波长。) (3) 第三行为激发波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长(通常终止波长应小于发射光谱的短波边,但允许有适量交叉) (4) 以下“记录范围”、“扫描速度”、“狭缝宽度”、“灵敏度”及“响应时间”的设置,与发射光谱测试时的设置相类似。 (5) 参数设置完成后,点击“OK”。 第二步:光谱测试。 点击屏幕右下角“Start”按钮,开始激发光谱测试。测试完成后,自动寻峰、数据转换、数据处理的操作与发射光谱相类似。3. 余辉衰减曲线的测试 第一步:参数设置。 点击“Acquire Mode”,在下拉菜单中选择“Time Course”模式,进行测试参数设置。 其中,参数设置对话框上半部分:激发波长(最大激发)、监测发光波长(最大发射)、狭缝宽度、灵敏度、响应时间及记录范围的设置与发射光谱、激发光谱测试时的设置相类似。 参数设置对话框下半部分:反应时间是指余辉衰减曲线的测试时间,即横坐标的扫描时间段;时间模式可选自动或手动;时间单位默认为秒。参数设置完成后,点击“OK”。 第二步:余辉衰减曲线测试 点击屏幕右下角“Start”按钮,开始余辉衰减曲线的测试。测试完成后,数据转换、数据处理的操作与发射光谱及激发光谱的操作相类似。
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