植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法.docx

1、植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋 在此过程应注意防止Rnase的污染。所使用的熔蜡管管盖不能耐受180烘，只需高压湿热灭菌即可、量筒、三角瓶和药勺均需180烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后假设不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。第一天 一、配制甲醛溶液以300 ml量为例1、先打开一个60左右的水浴锅。2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。3、用量筒配300 ml PBS缓

2、冲液30 ml 10PBS+270 ml水，另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛。5、置于冰上或4冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至。6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，一般用10 ml的小瓶。7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。 二、固定材料1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的

3、切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液固定液:材料20:1。3、材料放入固定液后，应通过抽真空1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准，帮助固定液进入组织中，以到达迅速固定植物材料的目的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。5、更换新鲜固定液后，材料在4过夜。 注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置

4、必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要防止将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及时清理。第二天 按以下序列对材料进行脱水水为高压灭过菌的双蒸水。1、0.85% NaCl 冰浴，30 分钟 2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时4、85%乙醇/0.85% NaCl 4， 过夜 注：进入50%乙醇后，材料应开始脱色。第三天1、95%乙醇/水 4，5小时2、100%乙醇 4，5小时3、100%乙醇 4，过夜 注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。第四天

5、 1、100%乙醇 室温，2小时2、50%乙醇/50% 二甲苯 室温，1小时 3、100% 二甲苯 室温，1小时4、100% 二甲苯 室温，1小时5、100% 二甲苯 室温，1小时6、50% 二甲苯/50%石蜡 58，过夜使用熔蜡台注：使用二甲苯 后，应在通风橱中操作，要防止让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。第五至七天每天换两次100%石蜡58，倾倒时防止产生气泡。注意：在换石蜡前1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。第八天纸盒的处理：将折好的纸盒于氯仿废氯仿可回收重复利用中泡一会，再取出晾干。包埋蜡块：先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上在纸盒上

6、写明材料的名称等有关内容，将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。用加热的镊子迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。用嘴吹气，使石蜡外表凝固形成一层薄膜时，再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框里晾干。包埋好的蜡块放入4冰箱中备用。二、载玻片和盖玻片的处理1、将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液2%HCl+70%乙醇溶液：70 ml 无水乙醇+2 ml浓HCl+28 ml H2O浸泡过夜，流水冲洗干净。2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片和盖玻片依次经过这6个烧杯，在干的纸上蘸干酒精后，于酒精灯

7、上烧干。3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。4、180烘5个小时。5、待载玻片冷却，加4 ul多聚-L-赖氨酸1mg/ml于一端。用盖玻片已经过180烘5个小时处理的一边接触液滴，进行涂片。涂片时应观察到“虹膜”的形成。注意：假设涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则说明载玻片没有洗干净，必须重洗。请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。6、涂片之后放入37 的烫板中干燥过夜最短可以4小时，水干了即可，准备切片。经过处理的载玻片应在一周内使用。7、 最后封片用的盖玻片不需作任何处理。使用前用擦镜纸擦净即可主要是防尘。三、切片和展片1、修块。将包有材料的小蜡块

8、包含一个材料初步修成六面体，粘在硬木块上。用刀片将蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可尽可能少留。2、切片。切片的厚度为7-10 um。在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。3、展片。将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上注意分清哪一面涂有多聚赖氨酸，将蜡带的反面注意正反面！漂浮于其上放入烫板上42进行展片。蜡带完全展开后数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度，吸去多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。置于42烫板上干燥过夜。4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。 植物组织RNA原位杂交第二部分 RNA探针的地高辛标记

9、一、转录模板的线性化 要转录的DNA150-1200bp，无polyA尾被克隆在合适转录载体的多克隆位点上，多克隆位点的外端带有SP6、T7或T3 RNA多聚酶的启动子，如pSK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。 转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切。为防止转录出非目的的RNA，应选用产生5端凸出或平端？的内切酶，酶切必须完全。酶切时要同时制备正义和反义DNA模板。酶切体系： 总体积 200 ul H2O 152或172 ul 10Buffer 20 ul 10BSA 0或20 ul 质粒1ug/ul 6 ul酶10 u/ul 6 ulRNase10mg/ml 6

10、 ul1、质粒终浓度为ug/ul，加入合适的内切酶及缓冲液200 ul酶切体系，在合适的温度下保温如37，2小时，电泳检查是否酶切完全。酶切后可以加入等体积的水200 ul，这样可以减少后面抽提时的损失注意：此时应该以混合后的体积作为1倍体积将3M的醋酸钠取出化冻2、酶切后，加入等体积的酚Tris饱和的酚，下层溶液才是酚200 ul：氯仿200 ul先加酚，振荡，再加氯仿，振荡抽提，12000转/别离心，5 min，取上清夜弃下层有机相到EP管中。再加等体积的氯仿400 ul抽提，12000转/别离心，5 min，取上清夜弃下层有机相到EP管中。再重复一次氯仿抽提，取上清。3、在上述水相中加入

11、3M的醋酸钠中和磷酸基团，有助于沉淀DNA，使终浓度到达由最后所得的上清液的体积决定。约1分半以后再加入2倍冰预冷的乙醇，置冰上1小时推荐是-20过夜。4、样品取出，12000g离心，10 min。弃上清，加400 ul 70%乙醇，颠倒混匀后再12000rpm离心 10 min。把残液吸尽后，真空干燥约1.5 min，重悬于水或1/10 TE溶液中使终浓度达ug/ul 视最初的质粒浓度来决定应加TE的体积，-20保存。二、RNA探针的标记下午开始做，先将Buffer，DDT，ATP，GTP，CTP和Dig-UTP化冻，不同公司用各自的一套反应体系。1、标记反应体系：室温下，以T7 RNA聚合

12、酶为例。宝丽曼反应体系 10 ul DEPC水要根据模板加样量决定ul 10T7 转录缓冲液 ul RNA酶抑制剂50u/ul ul 5mM ATP ul 5mM GTP ul 5mM CTPul 1mM DIG-UTP1 ul DNA线性模板ug1 ul T7 RNA聚合酶Total: 25 ulPromega的反应体系4-5ul DEPC水要根据模板加样量决定5 ul 5T7 转录缓冲液ul DDT(100mM)ul 5mM ATPul 5mM GTPul 5mM CTPul 1mM DIG-UTP1-2ul DNA线性模板ug，视模板浓度而定加样体积)ul RNA酶抑制剂(40u/ul)

13、1 ul T7 RNA聚合酶(20u/ul)Total: 25 ulTakara的反应体系4.5ul DEPC水要根据模板加样量决定ul 10SP6 转录缓冲液ul DDT(100mM)ul 0.1%BSAul 5mM ATPul 5mM GTPul 5mM CTPul 1mM DIG-UTP1.0ul DNA线性模板(0.05-ug，视模板浓度而定加样体积)0.6ul RNA酶抑制剂(40u/ul)1.0ul SP6 RNA聚合酶(10-50u/ul)Total: 25 ul此时将tRNA(100mg/ml)和3.8 M NH4Ac拿出来化冻并混匀。2、37温育2 小时此时可跑胶检测转录产物

14、的长度，但多省略。3、终止转录反应： 75 ul 1xMS 2 ul tRNA(100mg/ml)(Sigma, R4251,500 units, Type XXI, Ribonucleic acid, transfer,放在-20的EP管；它在万一有RNAase的情况下，则可以保护转录的RNA，牺牲自己去被降解；而且在沉淀的时候可以与合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情况下可以减少损失) 1 ul DNA酶无RNA酶污染的DNaseI(10u/ul) 4、37温育10分钟。5、沉淀： 100ul 3.8 M NH4Ac可增加离子浓度 600ul 乙醇冰上预冷6、-20 过夜。或在

15、干冰上10分钟，时间稍微长点没关系。配好明天用的70%乙醇/ NaCl溶液，体积视标记的数量而定，于4冰箱存放。早上过来先打开离心机和冷井制冷，同时打开60水浴。7、 样品取出，4 13000-15000转/分F2402转头，离心10分钟，弃上清。8、 用200ul冰预冷的70%乙醇/ NaCl冲洗沉淀H2O 405 ul+45 ul 5 M NaCl+1050 ul 乙醇。9、 4 13000转/分，离心10分钟。弃上清，真空干燥。10、加入50ul DEPC水4溶解10 min后再到下一步。11、加入50ul 2碳酸缓冲液，使终浓度为200mM12、60水解： 模板插入片段长度 水解时间

16、600-1200 bp 80-90分钟 400-500 bp 60分钟如Histone 200-400 bp 20-30分钟如cyclin 小于 200 bp 1-5 分钟此时取出10 % 醋酸和3M NaAc(pH 4.8)化冻。13、沉淀 10ul 10 % 醋酸 12ul 3M NaAc(pH 4.8) 312ul 乙醇冰预冷14、-20，2小时。此时打开冷井。15、重复7-9步。此时取出TE(pH 7.6)化冻。16、沉淀重悬于50ul TE(pH 7.6)中，置-20保存加入0.5ulRNasin(20u/ul)的RNA酶抑制剂，赵忠不加，因为他配的TE可靠，无RNase。三、RNA

17、探针的检测先配40 ml Dig 1和15 ml Dig 5溶液，再称取40 mg Blocking reagent加入8 ml Dig 1中配Dig 2溶液。1、点膜Southern用剩下的膜： ul待测探针; 1-5ng/ul地高辛标记的对照RNA 宝丽曼公司。 2、自然吹干。3、置于小培养皿中，用5 ml地高辛缓冲液1浸湿。4、地高辛缓冲液2中30分钟。5、在5ml用5 ml地高辛缓冲液1冲洗。6、在5ml地高辛缓冲液1+1ul地高辛抗体中30分钟。7、用5 ml地高辛缓冲液1冲洗2次，每次15分钟。8、用5 ml地高辛缓冲液5稍加冲洗。9、在地高辛缓冲液6中5ml地高辛缓冲液5中加入7

18、ul NBT 和 5ul BCIP暗处显色10分钟以上。第三部分 原位杂交 前一天晚上 每24张片子准备4-5升无菌水无须DEPC处理。 盖玻片24-30片/30片载玻片, 25 ml量筒1个、50 ml量筒5个、100 ml量筒1个、250ml量筒3个、500ml量筒7个，1000ml烧杯4个，250 ml三角瓶4个，500 ml三角瓶4个，1000 ml三角瓶8个，铁药勺3把，切片篮2个，平头镊2把。以上均需180烘5小时。 检查储备液 准备新灭菌的枪头、离心管。第 一 天1. 早上过来后先把下午实验所需的玻璃缸洗净：先自来水冲洗，双蒸水过一次，再用无水乙醇过一次，略晾干，最后用氯仿过一次

19、。然后置于通风橱中吹干备用。2. 同时准备以下12种溶液： 首先从准备多聚甲醛开始，Rnase处理之前的溶液均需用灭菌的蒸馏水配制，Rnase处理之后即可直接使用蒸馏水。将以下溶液倒入通风橱中的玻璃缸中：二甲苯 1和2 (2 X 300ml二甲苯溶液)100% 乙醇 1和2 2 X 300ml 无水乙醇溶液100% 乙醇8.5% NaCl水95% 乙醇285 ml- 15 ml85% 乙醇,0.85% NaCl255 ml30 ml 15 ml50% 乙醇,0.85% NaCl150 ml30 ml120 ml30% 乙醇,0.85% NaCl 90 ml30 ml180 ml0.85% Na

20、Cl-30 ml270 mlPBS 1和2 (2 X 300ml) 10X PBS 2 X 30 ml 水 2 X 270 ml链蛋白酶protease 0.125 mg/ml (300ml) 如果材料不同，则条件中需改变的是链蛋白酶的浓度及时间 20X链蛋白酶缓冲液 15 ml 水 285 ml 链蛋白酶粉剂 40 mg 甘氨酸 0.2% (300ml) 10X PBS 30 ml 水 264 ml 甘氨酸粉剂 克4% 多聚甲醛 (300ml) 10X PBS 30 ml 水 270 ml 多聚甲醛 12克 注意：1多聚甲醛有毒应在通风橱中称取配制，多聚甲醛极易飞散称取时通风橱不要抽风，防止

21、将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染。2PBS和水加入三角瓶后，加入2-3粒NaOH，摇匀加热到60。在通风橱中加入12 克多聚甲醛，用parafilm封口摇匀直到完全溶解。置于冰上降温，用硫酸调。调pH值时不要心急，20 ul一次慢慢地加。乙酸酐溶液溶于M三羟基乙基胺 pH 8 现用现配 2M 三羟基乙基胺 35 ml 水 665 ml 乙酸酐 3.6 ml注意：此溶液现配现用，置于600ml大缸中。大缸中先放入一个空的载片篮及转子，当盛满载玻片的载片篮放入玻璃缸、搅拌子开始搅拌时，再加入乙酸酐。一、组织预处理下午一点左右可以开始做。先打开37的水浴锅。切片经镜检后，装入不锈钢载片篮中24片

22、/篮，在通风橱中进行以下操作： 1二甲苯 1 10分钟 (1)2二甲苯 2 10分钟 3100%乙醇 1 1分钟 新鲜4100%乙醇 2 30秒 595%乙醇 30秒 685%乙醇，0.85% NaCl 30秒 750%乙醇，0.85% NaCl 30秒 830%乙醇，0.85% NaCl 30秒 90.85% NaCl 2分钟此时于37水浴中配链蛋白酶溶液，枪头助溶；同时第二篮开始进入脱水程序10PBS 1 2分钟(3)PBS溶液中可以多放置一会11链蛋白酶 10分钟37水浴，水解RNA上的蛋白，同时使探针容易进入12甘氨酸 2分钟终止链蛋白酶的反应13PBS 1 2分钟14多聚甲醛 10

23、分钟后固定的作用，将RNA与细胞中的蛋白交联再一起，同时可固定蛋白酶，同时应开始配乙酸酐溶液15PBS 1 2分钟16PBS 2 2分钟17乙酸酐 10分钟消除RNA上或细胞外表的正电荷18PBS 2 2分钟190.85% NaCl 2分钟3、上行脱水，从30%乙醇到100%乙醇100%乙醇1换成新鲜的。 注意: 对于第二篮: (1) 将原二甲苯 1倒掉回收，原二甲苯 2成为新二甲苯1，新加入的二甲苯 作为二甲苯 1。(2)系列乙醇可以再用。(3) 将原PBS 1倒掉，原PBS2仍为PBS2，新配的PBS作为PBS1。(4)玻璃缸用完后，用灭菌蒸馏水冲洗，加少量乙醇浸泡，用时吹干即可。上行结束

24、后，把载片篮取出，把无水乙醇吸干后用锡纸包好，留一个小口，与超净台上吹干。二、杂交 先打开80的水浴锅。1、准备杂交缓冲液32ul/张，可以多准备一些。24张载玻片10 X salt125ul甲酰胺a1500ultRNA(100mg/ml)ul50 X Denhardts25ul水ul50% dextran sulphate250ul总体积1000ul注意：50% dextran sulphate非常粘稠，加热后，再用剪去尖端的枪头加。2、震荡混合杂交缓冲液，离心，置于室温下。3、在冰上混合：每一张载玻片根据探针的浓度决定探针的加样量探针 2ul水 2ul甲酰胺a1 4ul4、将探针 /水/甲

25、酰胺混合物在80加热2分钟，离心，在冰上迅速冷却。5、将探针混合液8ul/张与杂交缓冲液32ul/张混合，震荡，离心，置于室温下。6、将载片篮拿出，吹干载玻片上乙醇。铺一层吸水纸，上面覆一层保鲜膜，还有平头镊子。7、每一张载玻片加38-40ul的杂交缓冲液/探针溶液，用处理过的盖玻片盖于其上，防止产生气泡。此时最好关空调，防止产生气泡8、准备2 X SSC,50% 甲酰胺 50ml/盒，8张载玻片/盒，共三盒 3 盒 6 盒 20 X SSC 15 ml 30 ml水 60 ml 120 ml甲酰胺b2 75 ml 150 ml9、将4张吸水纸双折，铺于盒底，加入50ml 2 X SSC,50

26、% 甲酰胺,再于纸上盖一层保鲜膜，载玻片置于其上。盖上盒盖，用胶带密封。、10、在50水浴中杂交过夜。注：甲酰胺a1-指去离子甲酰胺Molecular Biology grade，保存与冰箱中； 甲酰胺b2-国产，保存于通风橱下储藏柜。准备冲洗缓冲液和NTE溶液，明天备用；同时清洗装乙酸酐的盒子备用。第 二 天 如果在早上准备第四步地高辛缓冲液2，第三、四步可以在同一天内完成，共需12个小时。三、冲洗1、将一个水浴设定在37，如果要进行抗体染色第四步还需要一个50的水浴用于配置地高辛缓冲液2。2、准备冲洗缓冲液：每篮需要：1X500ml+3X300ml=1400ml冲洗缓冲液：2 X SSC,

27、50%甲酰胺b20 X SSC 50 ml 30 ml甲酰胺b250 ml150 ml水200 ml120 ml总体积500 ml300 ml 3、将载玻片放回入载片篮中。4、在800ml大塑料盒底部放入一个空载片篮，将装有载玻片的篮置于其上，加入700ml冲洗缓冲液。在50水浴中温育30分钟。 注意：此时盖玻片会落下。5、换入300ml玻璃缸，加入新鲜冲洗缓冲液，在50水浴中温育1小时30分钟。重复一次。6、在冲洗的过程中，准备NTE溶液 每篮需要：5 X 300 ml NTE 溶液1篮2篮5 X NTE 300 ml 600 ml 200 ml 水1200 ml2400 ml800 ml总

28、体积1500 ml3000 ml1000 ml7、用NTE溶液，在37水浴中冲洗两次，每次5分钟。8、载片篮放入RNA酶A溶液20ug/ml中,37水浴温育30分钟。RNA酶A溶液1篮2篮RNA酶A储备液10mg/ml0.6 ml1.2 mlNTE溶液300 ml600 ml 注意：1RNA酶A溶液应提前放入37水浴中预热5分钟。 2加入RNA酶A以后各步：直接使用蒸馏水仪的蒸馏水即可。 3加入RNA酶A之前和之后使用的玻璃缸一定要分开放置，切勿混用！ 4加入RNA酶A之前使用的玻璃缸，每次用完后冲洗干净，加入部分100%乙醇浸泡，下次使用前在通风橱中吹干即可。 9、准备如下溶液：1 X SS

29、C1篮2篮20 X SSC 15 ml 30 ml水285 ml570 mlPBS(每篮需要: 2 X 300 ml)1篮2篮10 X PBS 60 ml 120 ml水540 ml1080ml10、NTE溶液，室温冲洗两次，每次5分钟。11、冲洗缓冲液，50水浴，温育1小时。12、1 X SSC，室温，2分钟。13、PBS，室温，5分钟。四、抗体染色1、用上面的50的水浴用于配制地高辛缓冲液2因为有BSA的缘故，为半透明的溶液。2、准备如下溶液：地高辛缓冲液1100 mM Tris-Hcl,150 mM NaCl(每24片需800ml)24片载玻片48片载玻片10X地高辛缓冲液1 80 ml 160 ml水720 ml1440 ml地高辛缓冲液20.5%W/Vblocking reagent(每24片需90ml)3盒6盒Blocking reagent