植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法.docx

植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法.docx

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植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法

植物材料的固定、包埋和制片

一、植物材料的固定和包埋

在此过程应注意防止Rnase的污染。

所使用的熔蜡管〔管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可〕、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。

所用蒸馏水无需用DEPC处理。

所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。

材料取下后应立即固定。

取材后假设不能立即固定，则应置于冰上运输。

配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。

第一天

一、配制甲醛溶液〔以300ml量为例〕

1、先打开一个60℃左右的水浴锅。

2、在通风橱中往三角瓶中加入12g多聚甲醛（终浓度为4%）。

3、用量筒配300mlPBS缓冲液〔30ml10×PBS+270ml水〕，另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。

4、完全溶解后，取出，加0.1%Tween-20（300ul）和0.1%Triton（300ul）混匀〔包埋水稻时还要再加3ml25%的戊二醛〕。

5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH至。

6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，〔一般用10ml的小瓶〕。

7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。

二、固定材料

1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。

注意：

所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。

2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。

注意每瓶中的切块数：

太多固定不好；太少则浪费固定液〔固定液:

材料≥20:

1〕。

3、材料放入固定液后，应通过抽真空〔1至数分钟，视具体情况而定：

尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准〕，帮助固定液进入组织中，以到达迅速固定植物材料的目的。

抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。

抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。

一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。

4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。

5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。

注意：

甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！

多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要防止将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及时清理。

第二天按以下序列对材料进行脱水〔水为高压灭过菌的双蒸水〕。

1、0.85%NaCl冰浴，30分钟

2、50%乙醇/0.85%NaCl冰浴，5小时

3、70%乙醇/0.85%NaCl冰浴，5小时

4、85%乙醇/0.85%NaCl4℃，过夜

注：

进入50%乙醇后，材料应开始脱色。

第三天

1、95%乙醇/水4℃，5小时

2、100%乙醇4℃，5小时

3、100%乙醇4℃，过夜

注：

第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。

两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。

第四天

1、100%乙醇室温，2小时

2、50%乙醇/50%二甲苯室温，1小时

3、100%二甲苯室温，1小时

4、100%二甲苯室温，1小时

5、100%二甲苯室温，1小时

6、50%二甲苯/50%石蜡58℃，过夜〔使用熔蜡台〕

注：

使用二甲苯后，应在通风橱中操作，要防止让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。

第五至七天

每天换两次100%石蜡〔58℃〕，倾倒时防止产生气泡。

注意：

在换石蜡前1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。

第八天

纸盒的处理：

将折好的纸盒于氯仿〔废氯仿可回收重复利用〕中泡一会，再取出晾干。

包埋蜡块：

先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上〔在纸盒上写明材料的名称等有关内容〕，将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。

用加热的镊子迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。

用嘴吹气，使石蜡外表凝固形成一层薄膜时，再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。

约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框里晾干。

包埋好的蜡块放入4℃冰箱中备用。

二、载玻片和盖玻片的处理

1、将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液〔2%HCl+70%乙醇溶液：

70ml无水乙醇+2ml浓HCl+28mlH2O〕浸泡过夜，流水冲洗干净。

2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片和盖玻片依次经过这6个烧杯，在干的纸上蘸干酒精后，于酒精灯上烧干。

3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。

4、180℃烘5个小时。

5、待载玻片冷却，加4ul多聚-L-赖氨酸〔1mg/ml〕于一端。

用盖玻片〔已经过180℃烘5个小时处理〕的一边接触液滴，进行涂片。

涂片时应观察到“虹膜”的形成。

注意：

假设涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则说明载玻片没有洗干净，必须重洗。

请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。

6、涂片之后放入37℃的烫板中干燥过夜〔最短可以4小时，水干了即可〕，准备切片。

经过处理的载玻片应在一周内使用。

。

7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。

使用前用擦镜纸擦净即可〔主要是防尘〕。

三、切片和展片

1、修块。

将包有材料的小蜡块〔包含一个材料〕初步修成六面体，粘在硬木块上。

用刀片将蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可〔尽可能少留〕。

2、切片。

切片的厚度为7-10um。

在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。

3、展片。

将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上〔注意分清哪一面涂有多聚赖氨酸〕，将蜡带的反面〔注意正反面！

〕漂浮于其上放入烫板上〔42℃〕进行展片。

蜡带完全展开后〔数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度〕，吸去多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。

置于42℃烫板上干燥过夜。

4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。

植物组织RNA原位杂交

第二部分RNA探针的地高辛标记

一、转录模板的线性化

要转录的DNA〔150-1200bp，无polyA尾〕被克隆在合适转录载体的多克隆位点上，多克隆位点的外端带有SP6、T7或T3RNA多聚酶的启动子，如pSK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。

转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切。

为防止转录出非目的的RNA，应选用产生5’端凸出〔或平端？

〕的内切酶，酶切必须完全。

酶切时要同时制备正义和反义DNA模板。

酶切体系：

总体积200ul

H2O152或172ul

10×Buffer20ul

10×BSA0或20ul

质粒〔1ug/ul〕6ul

酶〔10u/ul〕6ul

RNase〔10mg/ml〕6ul

1、质粒终浓度为ug/ul，加入合适的内切酶及缓冲液〔200ul酶切体系〕，在合适的温度下保温〔如37℃，2小时〕，电泳检查是否酶切完全。

酶切后可以加入等体积的水〔200ul〕，这样可以减少后面抽提时的损失〔注意：

此时应该以混合后的体积作为1倍体积〕

将3M的醋酸钠取出化冻

2、酶切后，加入等体积的酚〔Tris饱和的酚，下层溶液才是酚〕〔200ul〕：

氯仿〔200ul〕〔先加酚，振荡，再加氯仿，振荡〕抽提，12000转/别离心，5min，取上清夜〔弃下层有机相〕到EP管中。

再加等体积的氯仿〔400ul〕抽提，12000转/别离心，5min，取上清夜〔弃下层有机相〕到EP管中。

再重复一次氯仿抽提，取上清。

3、在上述水相中加入3M的醋酸钠〔中和磷酸基团，有助于沉淀DNA〕，使终浓度到达〔由最后所得的上清液的体积决定〕。

约1分半以后再加入2倍冰预冷的乙醇，置冰上1小时〔推荐是-20℃过夜〕。

4、样品取出，12000g离心，10min。

弃上清，加400ul70%乙醇，颠倒混匀后再12000rpm离心10min。

把残液吸尽后，真空干燥〔约1.5min〕，重悬于水或1/10TE〔〕溶液中使终浓度达ug/ul〔视最初的质粒浓度来决定应加TE的体积〕，-20℃保存。

二、

RNA探针的标记

下午开始做，先将Buffer，DDT，ATP，GTP，CTP和Dig-UTP化冻，不同公司用各自的一套反应体系。

1、标记反应体系：

〔室温下，以T7RNA聚合酶为例。

〕

宝丽曼反应体系

10ulDEPC水〔要根据模板加样量决定〕

ul10×T7转录缓冲液

ulRNA酶抑制剂〔50u/ul〕

ul5mMATP

ul5mMGTP

ul5mMCTP

ul1mMDIG-UTP

1ulDNA线性模板〔ug〕

1ulT7RNA聚合酶

Total:

25ul

Promega的反应体系

4-5ulDEPC水〔要根据模板加样量决定〕

5ul5×T7转录缓冲液

ulDDT（100mM）

ul5mMATP

ul5mMGTP

ul5mMCTP

ul1mMDIG-UTP

1-2ulDNA线性模板ug，视模板浓度而定加样体积）

ulRNA酶抑制剂（40u/ul）

1ulT7RNA聚合酶（20u/ul）

Total:

25ul

Takara的反应体系

4.5ulDEPC水〔要根据模板加样量决定〕

ul10×SP6转录缓冲液

ulDDT（100mM）

ul0.1%BSA

ul5mMATP

ul5mMGTP

ul5mMCTP

ul1mMDIG-UTP

1.0ulDNA线性模板（0.05-ug，视模板浓度而定加样体积）

0.6ulRNA酶抑制剂（40u/ul）

1.0ulSP6RNA聚合酶（10-50u/ul）

Total:

25ul

此时将tRNA（100mg/ml）和3.8MNH4Ac拿出来化冻并混匀。

2、37℃温育2小时〔此时可跑胶检测转录产物的长度，但多省略〕。

3、终止转录反应：

75ul1xMS

2ultRNA（100mg/ml）（Sigma,R4251,500units,TypeXXI,Ribonucleicacid,transfer,放在-20℃的EP管；它在万一有RNAase的情况下，则可以保护转录的RNA，牺牲自己去被降解；而且在沉淀的时候可以与合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情况下可以减少损失）

1ulDNA酶〔无RNA酶污染的DNaseI（10u/ul）〕

4、37℃温育10分钟。

5、沉淀：

100ul3.8MNH4Ac〔可增加离子浓度〕

600ul乙醇〔冰上预冷〕

6、-20℃过夜。

〔或在干冰上10分钟，时间稍微长点没关系〕。

配好明天用的70%乙醇/NaCl溶液，体积视标记的数量而定，于4℃冰箱存放。

早上过来先打开离心机和冷井制冷，同时打开60℃水浴。

7、样品取出，4℃13000-15000转/分〔F2402转头〕，离心10分钟，弃上清。

8、用200ul冰预冷的70%乙醇/NaCl冲洗沉淀〔H2O405ul+45ul5MNaCl+1050ul乙醇〕。

9、4℃13000转/分，离心10分钟。

弃上清，真空干燥。

10、加入50ulDEPC水〔4℃溶解10min后再到下一步〕。

11、加入50ul2×碳酸缓冲液〔，使终浓度为200mM〕

12、60℃水解：

模板〔插入片段〕长度水解时间

600-1200bp80-90分钟

400-500bp60分钟〔如Histone〕

200-400bp20-30分钟〔如cyclin〕

小于200bp1-5分钟

此时取出10%醋酸和3MNaAc（pH4.8）化冻。

13、沉淀10ul10%醋酸

12ul3MNaAc（pH4.8）

312ul乙醇〔冰预冷〕

14、-20℃，2小时。

此时打开冷井。

15、重复7-9步。

此时取出TE（pH7.6）化冻。

16、沉淀重悬于50ulTE（pH7.6）中，置-20℃保存〔加入0.5ulRNasin（20u/ul）的RNA酶抑制剂，赵忠不加，因为他配的TE可靠，无RNase〕。

三、RNA探针的检测

先配40mlDig1和15mlDig5溶液，再称取40mgBlockingreagent加入8mlDig1中配Dig2溶液。

1、点膜〔Southern用剩下的膜〕：

ul待测探针;

1-5ng/ul地高辛标记的对照RNA〔宝丽曼公司〕。

2、自然吹干。

3、置于小培养皿中，用5ml地高辛缓冲液1浸湿。

4、地高辛缓冲液2中30分钟。

5、在5ml用5ml地高辛缓冲液1冲洗。

6、在5ml地高辛缓冲液1+1ul地高辛抗体中30分钟。

7、用5ml地高辛缓冲液1冲洗2次，每次15分钟。

8、用5ml地高辛缓冲液5稍加冲洗。

9、在地高辛缓冲液6中〔5ml地高辛缓冲液5中加入7ulNBT和5ulBCIP〕暗处显色10分钟以上。

第三部分原位杂交

前一天晚上

每24张片子准备4-5升无菌水〔无须DEPC处理〕。

盖玻片〔24-30片/30片载玻片〕,25ml量筒1个、50ml量筒5个、100ml量筒1个、250ml量筒3个、500ml量筒7个，1000ml烧杯4个，250ml三角瓶4个，500ml三角瓶4个，1000ml三角瓶8个，铁药勺3把，切片篮2个，平头镊2把。

以上均需180℃烘5小时。

检查储备液

准备新灭菌的枪头、离心管。

第一天

1.早上过来后先把下午实验所需的玻璃缸洗净：

先自来水冲洗，双蒸水过一次，再用无水乙醇过一次，略晾干，最后用氯仿过一次。

然后置于通风橱中吹干备用。

2.同时准备以下12种溶液：

首先从准备多聚甲醛开始，Rnase处理之前的溶液均需用灭菌的蒸馏水配制，Rnase处理之后即可直接使用蒸馏水。

将以下溶液倒入通风橱中的玻璃缸中：

二甲苯1和2（2X300ml二甲苯溶液）

100%乙醇1和2〔2X300ml无水乙醇溶液〕

100%乙醇

8.5%NaCl

水

95%乙醇

285ml

---

15ml

85%乙醇,0.85%NaCl

255ml

30ml

15ml

50%乙醇,0.85%NaCl

150ml

30ml

120ml

30%乙醇,0.85%NaCl

90ml

30ml

180ml

0.85%NaCl

---

30ml

270ml

PBS1和2（2X300ml）

10XPBS2X30ml

水2X270ml

链蛋白酶〔protease〕0.125mg/ml（300ml）

〔如果材料不同，则条件中需改变的是链蛋白酶的浓度及时间〕

20X链蛋白酶缓冲液15ml

水285ml

链蛋白酶粉剂40mg

甘氨酸0.2%（300ml）

10XPBS30ml

水264ml

甘氨酸粉剂克

4%多聚甲醛（300ml）

10XPBS30ml

水270ml

多聚甲醛12克

注意：

〔1〕多聚甲醛有毒应在通风橱中称取配制，多聚甲醛极易飞散称取时通风橱不要抽风，防止将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染。

〔2〕PBS和水加入三角瓶后，加入2-3粒NaOH，摇匀加热到60℃。

在通风橱中加入12克多聚甲醛，用parafilm封口摇匀直到完全溶解。

置于冰上降温，用硫酸调。

调pH值时不要心急，20ul一次慢慢地加。

乙酸酐溶液〔溶于M三羟基乙基胺pH8〕〔现用现配〕

2M三羟基乙基胺35ml

水665ml

乙酸酐3.6ml

注意：

此溶液现配现用，置于600ml大缸中。

大缸中先放入一个空的载片篮及转子，当盛满载玻片的载片篮放入玻璃缸、搅拌子开始搅拌时，再加入乙酸酐。

一、

组织预处理

下午一点左右可以开始做。

先打开37℃的水浴锅。

切片经镜检后，装入不锈钢载片篮中〔24片/篮〕，在通风橱中进行以下操作：

〔1〕二甲苯110分钟

（1）

〔2〕二甲苯210分钟

〔3〕100%乙醇11分钟←←↑〔新鲜〕

〔4〕100%乙醇230秒↑

〔5〕95%乙醇30秒↑

〔6〕85%乙醇，0.85%NaCl30秒↑

〔7〕50%乙醇，0.85%NaCl30秒↑

〔8〕30%乙醇，0.85%NaCl30秒→→↑

〔9〕0.85%NaCl2分钟〔此时于37℃水浴中配链蛋白酶溶液，枪

头助溶；同时第二篮开始进入脱水程序〕

〔10〕PBS12分钟（3）〔PBS溶液中可以多放置一会〕

〔11〕链蛋白酶10分钟〔37℃水浴，水解RNA上的蛋白，同时使探

针容易进入〕

〔12〕甘氨酸2分钟〔终止链蛋白酶的反应〕

〔13〕PBS12分钟

〔14〕多聚甲醛10分钟〔后固定的作用，将RNA与细胞中的蛋白交

联再一起，同时可固定蛋白酶，同时应开

始配乙酸酐溶液〕

〔15〕PBS12分钟

〔16〕PBS22分钟

〔17〕乙酸酐10分钟〔消除RNA上或细胞外表的正电荷〕

〔18〕PBS22分钟

〔19〕0.85%NaCl2分钟

3、上行〔↑〕脱水，从30%乙醇到100%乙醇〔‘100%乙醇1’换成新鲜的〕。

注意:

对于第二篮:

（1）将原‘二甲苯1’倒掉〔回收〕，原‘二甲苯2'成为新二甲苯1，新加入的二甲苯作为二甲苯1。

（2）系列乙醇可以再用。

（3）将原PBS1倒掉，原PBS2仍为PBS2，新配的PBS作为PBS1。

（4）玻璃缸用完后，用灭菌蒸馏水冲洗，加少量乙醇浸泡，用时吹干即可。

上行结束后，把载片篮取出，把无水乙醇吸干后用锡纸包好，留一个小口，与超净台上吹干。

二、杂交

先打开80℃的水浴锅。

1、准备杂交缓冲液〔32ul/张，可以多准备一些。

〕

24张载玻片

10Xsalt

125ul

甲酰胺a〔1〕

500ul

tRNA（100mg/ml）

ul

50XDenhardt's

25ul

水

ul

50%dextransulphate

250ul

总体积

1000ul

注意：

50%dextransulphate非常粘稠，加热后，再用剪去尖端的枪头加。

2、震荡混合杂交缓冲液，离心，置于室温下。

3、在冰上混合：

〔每一张载玻片〕〔根据探针的浓度决定探针的加样量〕

探针2ul

水2ul

甲酰胺a〔1〕4ul

4、将探针/水/甲酰胺混合物在80℃加热2分钟，离心，在冰上迅速冷却。

5、将探针混合液〔8ul/张〕与杂交缓冲液〔32ul/张〕混合，震荡，离心，置于室温下。

6、将载片篮拿出，吹干载玻片上乙醇。

铺一层吸水纸，上面覆一层保鲜膜，还有平头镊子。

7、每一张载玻片加38-40ul的杂交缓冲液/探针溶液，用处理过的盖玻片盖于其上，防止产生气泡。

〔此时最好关空调，防止产生气泡〕

8、准备2XSSC,50%甲酰胺〔50ml/盒，8张载玻片/盒，共三盒〕

3盒6盒

20XSSC15ml30ml

水60ml120ml

甲酰胺b〔2〕75ml150ml

9、将4张吸水纸双折，铺于盒底，加入50ml2XSSC,50%甲酰胺,再于纸上盖一层保鲜膜，载玻片置于其上。

盖上盒盖，用胶带密封。

、

10、在50℃水浴中杂交过夜。

注：

甲酰胺a〔1〕----指去离子甲酰胺〔MolecularBiologygrade〕，保存与冰箱中；

甲酰胺b〔2〕---国产，保存于通风橱下储藏柜。

准备冲洗缓冲液和NTE溶液，明天备用；同时清洗装乙酸酐的盒子备用。

第二天

如果在早上准备第四步地高辛缓冲液2，第三、四步可以在同一天内完成，共需12个小时。

三、冲洗

1、将一个水浴设定在37℃，如果要进行抗体染色〔第四步〕还需要一个50℃的水浴用于配置地高辛缓冲液2。

2、准备冲洗缓冲液：

〔每篮需要：

1X500ml+3X300ml=1400ml〕

冲洗缓冲液：

2XSSC,50%甲酰胺b

20XSSC

50ml

30ml

甲酰胺b

250ml

150ml

水

200ml

120ml

总体积

500ml

300ml

3、将载玻片放回入载片篮中。

4、在800ml大塑料盒底部放入一个空载片篮，将装有载玻片的篮置于其上，加入700ml冲洗缓冲液。

在50℃水浴中温育30分钟。

注意：

此时盖玻片会落下。

5、换入300ml玻璃缸，加入新鲜冲洗缓冲液，在50℃水浴中温育1小时30分钟。

重复一次。

6、在冲洗的过程中，准备NTE溶液〔每篮需要：

5X300ml〕

NTE溶液

1篮

2篮

5XNTE

300ml

600ml

200ml

水

1200ml

2400ml

800ml

总体积

1500ml

3000ml

1000ml

7、用NTE溶液，在37℃水浴中冲洗两次，每次5分钟。

8、载片篮放入RNA酶A溶液〔20ug/ml〕中,37℃水浴温育30分钟。

RNA酶A溶液

1篮

2篮

RNA酶A储备液10mg/ml

0.6ml

1.2ml

NTE溶液

300ml

600ml

注意：

〔1〕RNA酶A溶液应提前放入37℃水浴中预热5分钟。

〔2〕加入RNA酶A以后各步：

直接使用蒸馏水仪的蒸馏水即可。

〔3〕加入RNA酶A之前和之后使用的玻璃缸一定要分开放置，切勿混用！

〔4〕加入RNA酶A之前使用的玻璃缸，每次用完后冲洗干净，加入部分100%乙醇浸泡，下次使用前在通风橱中吹干即可。

9、准备如下溶液：

1XSSC

1篮

2篮

20XSSC

15ml

30ml

水

285ml

570ml

PBS（每篮需要:

2X300ml）

1篮

2篮

10XPBS

60ml

120ml

水

540ml

1080ml

10、NTE溶液，室温冲洗两次，每次5分钟。

11、冲洗缓冲液，50℃水浴，温育1小时。

12、1XSSC，室温，2分钟。

13、PBS，室温，5分钟。

四、抗体染色

1、用上面的50℃的水浴用于配制地高辛缓冲液2〔因为有BSA的缘故，为半透明的溶液〕。

2、准备如下溶液：

地高辛缓冲液1〔100mMTris-Hcl,150mMNaCl〕（每24片需800ml）

24片载玻片

48片载玻片

10X地高辛缓冲液1

80ml

160ml

水

720ml

1440ml

地高辛缓冲液2〔0.5%[W/V]blockingreagent〕（每24片需90ml）

3盒

6盒

Blockingreagent