杞菊地黄丸浓缩丸的质量分析资料.docx

1、杞菊地黄丸浓缩丸的质量分析资料 杞菊地黄丸（浓缩丸）的质量分析实验仪器：锥形瓶、5ml量瓶、50ml量瓶、量筒、高效液相色谱仪、UV 2101P C紫外可见分光光度计、超声波振荡仪、紫外二极管阵列检测器、0. 45m 微孔滤膜、紫外灯实验试剂：甲醇、甲酸、甲苯、乙醚、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、浓氨试液、重蒸馏水 ( 临用前制备)、冰醋酸、环己烷 、水饱和正丁醇、0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、盐酸盐 5%三氯化铁乙醇溶液、5% 硅钨酸乙醇溶液、0.1%的2 ,2 -二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液、10%硫酸乙醇溶液、三氯化铝试液、10%磷钼酸乙醇溶液、2%香草醛硫酸乙醇溶液、十八烷基

2、硅烷键合硅胶、中性氧化铝、PhenomenexC 18、 硅胶G薄层板、硅胶H 薄层板、聚酰胺薄膜、实验样品：马钱苷对照品、丹皮酚对照品、知柏地黄丸(浓缩丸)、缺牡丹皮的杞菊地黄丸( 浓缩丸)、23-乙酰泽泻醇B对照品、毛蕊花糖苷对照品、熊果酸对照品、绿原酸对照品、枸杞子对照药材、菊花对照药材、落新妇苷对照品、山药对照药材、一、酒萸肉和牡丹皮的含量测定（1） 酒萸肉 （酒萸肉又叫山茱萸,本品主要使用为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉 ，酒萸肉提取物中主要含莫诺苷、马钱苷等成分。）方法1 照高效液相色谱法（2015年版药典一部附录D）测定1色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

3、以甲醇乙腈0.1%磷酸溶液（5：9：86）为流动相；检测波长为236nm。理论板数按马钱苷峰计算应不低于4000。2对照品溶液的制备取马钱苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含40g的溶液，即得。3供试品溶液的制备取本品适量，研碎，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，加在中性氧化铝柱（100200目，4g，内径为1cm）上，用40%甲醇50ml洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，

4、滤过，取续滤液，即得。4测定法分别精密吸取对照品溶液10l与供试品溶液510l，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1g含酒萸肉以马钱苷（C17H26O10）计，不得少于1.11mg。方法2 RP -HP L C法对杞菊地黄丸( 浓缩丸) 中马钱苷进行含量测定1、色谱条件色谱柱: Di a mo n s i l -C 18( 250 mm4. 6 mm, 5 m) ; 流动相: 乙腈- 甲醇-0. 1%磷酸溶液( 10 5 85)，（流动相对样品测定影响较大建议尝试四氢呋喃-乙腈-甲醇(1 84)- 0. 05% 磷酸溶液比较）; 流速: 1 mL/mi n ,检测波长: 236 n m, 柱温

5、: 室温（ 柱温仅对保留时间有影响， 对样品分离无影响， 考虑到出峰时间，有的选择柱温为 40 ，与 2010年版中国药典 一部一致。） 理论板数以马钱苷峰计算,不低于 4 000。2 、线性范围2.1测定波长的选择 取马钱苷对照品溶液， 在含量测定条件下， 以 HPLC-DAD 法进行紫外光谱全波长扫描测定， 得到紫外吸收光谱图， 最大吸收波长为 238 nm，参考中国药典 2015年版一部明目地黄丸酒萸肉含量测定项 下 的 检 测 波 长， 最 后 确 定 测 定 波 长 为236nm 2.2精密称取马钱苷对照品 12. 42 mg , 置 50 mL量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇

6、匀, 作为对照品储备液, 分别吸取对照品储备液 1, 3, 5, 7, 10 ml置 50 ml量瓶中, 加 85%甲醇至刻度, 分别进样 20 L , 在236nm 测定其峰面积, 以峰面积为纵坐标, 对照品进样量为横坐标, 绘制标准曲线。 求回归方程（参考结果：Y=1 033 962. 149X+3 383. 116, R=0. 999 6。试验 表明, 进样量在 0. 090 0 0. 900 g范围内, 马钱苷峰面积与进样量有良好线性关系。）2.3重复性试验分别精密称取同一批号样品 6份, 用 6个测定结果进行评价。按样品测定项下的方法进行测定。（参考结果其平均含量为1. 17 mg

7、/g , R S D为 1. 1%, 表明重复性较好。）2.4稳定性试验 考察对照品溶液、供试品溶液的稳定性。精密吸取对照品溶液、供试品溶液 10 L , 分别在制备后 0, 2, 4, 8 h按样品测定项下的方法进行峰面积测定。（参考结果： 计算峰面积, RS D分别为0. 7%、0. 6%, 表明稳定性较好。）2.5加样回收率试验精密称取同一批号样品 6 份, 用 6 个测定结果进行评价。 精密加入马钱苷对照品溶液一定量, 按样品测定项下的供试品溶液制备方法进行制备、测定, 计算回收率。2.6专属性试验阴性对照样品除山茱萸外 , 其它七味药按生产工艺制成。阴性对照溶液按供试品溶液制备方法制

8、得 , 按样品测定项下方法进行测定 。2.7样品测定取本品适量 , 研碎 , 取约 1g , 用 8 5%甲醇 20m L 分 3次(每次 15 m i n ) 超声振荡提取, 滤过,弃去滤液,合并滤渣, 精密称定 , 置具塞锥形瓶中, 精密加入85%甲醇50 mL , 密塞 ,称定重量 ,加热回流 1 h , 放冷, 再称定重量,用85%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过, 取续滤液 , 作为供试品溶液,每次进样 20 L 。（参考结论：通过改变其组成 , 发现在流动相乙腈 - 甲醇 -0. 1%磷酸溶液 (10 5 85) ,马钱苷峰与其它成分有较好的分离,保留时间适中 , 效果良好。85%的

9、甲醇溶剂中马钱苷含量最高。）（2）牡丹皮方法1 牡丹皮薄层层析取本品粉末5g ,加乙醚,滤过,滤液挥干,残渣加丙酮 1ml溶解作为供试品溶液。同法制备阴性对照溶液。另取丹皮酚对照品,加丙酮制成每1ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液,吸取上述三种溶液各10l ,分别点于同一硅胶 G 薄层板上 ,以环己烷 -醋酸乙酯( 3 : 1) 为展开剂,展开,取出,晾干,喷以盐酸盐 5%三氯化铁乙醇溶液 ,加热至斑点显色清晰。在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。 方法2 现用高效液相色谱法测定1条件用 C 18柱 ,流动相为甲醇 - 水 ( 55: 45) , 检测波长为 274n m, 流

10、速为 1. 0 ml /mi n , 柱温 : 30。结果丹皮酚进样量在 0. 7674g 5. 116g 范围内线性关系良好 ( r =0. 9999) , 平均加样回收率为 103. 3%(RS D=0. 9%)。2 方法与结果2. 1 色谱条件 色谱柱为 Di a mo n s i lC 18 5 m( 200 mm4. 6mm)色谱 柱; 流 动相 为甲 醇- 水 (55 45) ;检测 波 长为274n m; 流速为 1. 0 ml /mi n ; 进样量为 20l 。 柱温: 30。 理论板数按丹皮酚峰计算应不低于 5000。2. 2 线性关系与考察 取丹皮酚对照品约 15 mg

11、, 精密称定, 置 25 ml 量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 用甲醇分别 制成每 1 ml 含丹 皮酚 38. 37g 、 63. 59g 、 76. 74g 、127. 90g 、153. 48g 、255. 80 g的对照品溶液, 精密吸取上述溶液各 20l , 在上述色谱条件下, 分别进样 5次, 记录色谱图, 以浓度 X为横坐标, 峰面积 Y为纵坐标, 计算线性回归方程: Y= 6195274. 2 X+186908. 8 r=0. 9999, 结果表明丹皮酚在 0. 7674g 5. 116g范围内呈良好的线性关系。2. 3 精密度考察 精密吸取丹皮酚对照品溶液 20l

12、 , 按上述色谱条件, 重复进样 5次, 测定其峰面积值, 结果丹皮酚峰面积的 R S D为 0. 1%, 表明测定方法的精密度良好。2. 4 重现性考察 取同一批号的样品, 照供试液制备方法平行制备5份供试品溶液, 分别进样测定, 记录峰面积。结果含量的RSD为0. 3%, 表明测定方法的重复性良好。2. 5 稳定性考察 取供试品溶液, 于配制后第 0、2、4、6、8小时分别进样测定, 记录峰面积, 丹皮酚峰面积的 RS D为0. 6%。结果表明该溶液在8 h内几乎无变化, 可满足实验的要求。2. 6 阴性对照试验 照处方比例制备缺牡丹皮的杞菊地黄丸( 浓缩丸) , 依照 2. 8项下操作,

13、 制备阴性供试液。在上述色谱条件下, 测定。 结果在丹皮酚的峰位上未出现色谱峰,说明阴性对照无干扰。2. 7 加样回收试验 精密称取已知含量的样品5份, 每份约1. 5 g , 分别加入定量的丹皮酚对照品。按“ 2.8”项下方法制备成供试品液, 测定含量。结果方法的加样回收率为103. 3%, R S D=0. 9%, 表明方法准确度良好2. 8 样品测定 取3 g研细的样品, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入50%甲醇50 ml , 密塞, 称定重量, 超声处理（功率 120W, 频率 58KHz ) 45 mi n , 放冷, 再称定重量, 用 50%甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤

14、过, 取续滤液, 即得。方法3 照高效液相色谱法（2015年版药典一部附录 D）测定1色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇水（70：30）为流动相；检测波长为274nm。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于3500。2对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20g的溶液，即得。3供试品溶液的制备取本品适量，研碎，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率220W，频率25kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。4测定法分别精密吸取对照品溶液与供

15、试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1g含牡丹皮以丹皮酚（C9H10O3）计，不得少于1.1mg。方法4 HPLC 波长切换技术同时测定1实验条件1.1提取方法的选择 以50%甲醇溶液为溶剂，加热回流60 min。1.2检测波长的选择 用紫外二极管阵列检测器在200450nm范围内进行光谱扫描，结合液相色谱图，将波长设定为045min时采用检测波长240 nm，4665min时采用检测波长274 nm1.3流动相 乙腈(A)0.3%磷酸溶液(B)，梯度洗脱。2.方法与结果2. 1 混合对照品溶液的制备 精密称取莫马钱苷和丹皮酚的对照品适量，用50%甲醇制成含马钱苷76.4gmL

16、1 、丹皮酚98.2gmL 1的混合溶液，即得。2. 2 供试品溶液的制备 取样品适量，研细，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇检测波长:在0 45 min、240 nm 波长下检测马钱苷，在 46 65 min、274 nm 波长下检测丹皮酚。加甲醇25 mL，密塞，称量，加热回流1 h，取出，放冷，再称量，用50%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，经0. 45m微孔滤膜过滤，即得。2. 3 阴性样品溶液的制备 按照处方制备缺山茱萸(制)、知母、牡丹皮的阴性样品。按“2. 2”项下方法制备阴性样品溶液。2. 4 色谱条件 色谱柱:Phenomenex C18

17、(4.6 mm250 mm，5m);流动相:乙腈(A)0.3% 磷酸溶液(B)，梯度洗脱(05 min，5%A 7%A;5 26 min，、7%A;26 45 min，7%A 20%A;45 55 min， 20%A 60%A;55 65 min，60% A);流速:1 mL min1 ;柱温:40 ;检测波长:在0 45 min、240 nm 波长下检测马钱苷， 在 46 65 min、 274 nm 波长下检测丹皮酚。2. 5 系统适用性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10L，在“2. 4”项色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图。2. 6 线性关系考察 精密

18、称取混合对照品溶液1、3、6、10、15、20L 分别进样测定，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X) 为横坐标进行线性回归。（参考结果：马钱苷进样量在 0. 076 41. 528g，丹皮酚进样量在 0. 098 21. 964g 范围内与峰面积呈良好线性关系。）2. 7 精密度试验 精密称取同一批杞菊地黄丸(浓缩丸)， 按“2. 2”项下方法制备供试品溶液。按“2. 4”项下色谱条件连续进样 6 次，每次进样10 L， 测得马钱苷、丹皮酚峰面积的SD( n = 6) 2. 8 稳定性试验 精密称取同一批知柏地黄丸(浓缩丸)， 按“2. 2” 项下方法制备供试品溶液。按“2. 4”项下色谱条件

19、分别在第 0、3、 6、9、12、15h 进样10L进行测定，测得马钱苷、丹皮酚峰面积的SD ( n = 6 ) 2. 9 重复性试验 精密称取同一批知柏地黄丸(浓缩丸)粉末 6 份， 分别按“2. 2” 项下方法制备供试品溶液。按“2. 4”项下色谱条件进样 10 L 进行测定，测得马钱苷、丹皮酚峰面积的SD ( n = 6 ) 2. 10 准确度 精密称取已知含量的样品 0. 2 g，共 6 份，分别置锥形瓶中，精密加入混合对照品的 50% 甲醇溶液(马钱苷 15. 28 gmL1，丹皮酚 19. 64 gmL1 )25 mL，按“2. 2”项下方法制备加样供试溶液。精密吸取对照品溶液与加

20、样供试溶液各10L，分别注入液相色谱仪，测定回收率。2、本品中枸杞子、熟地黄、酒萸肉 、牡丹皮等八味药的理化鉴别（1）牡丹皮的理化鉴别取本品lg，加乙醚10ml密塞,振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10l分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（110)，在105C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。（2）枸杞

21、子的理化鉴别取本品15g，研碎，加水 100ml，加热回流30分钟，放冷 ，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热回流30分钟，放冷， 离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（通 则0502)试验， 吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15 : 2 : 1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显

22、相同颜色的荧光斑点（3）熟地黄的理化鉴别取本品lg ,加80%甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4 次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每l ml含l mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液5l、对照品溶液2l，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16 : 0. 5 : 2)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2 ,2 -二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸渍，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，

23、显相同的颜色斑点。（4）酒萸肉的理化鉴别取本品0.5g,加乙酸乙酯10ml,超声处理15分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每l ml含l mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5l,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20 : 4 : 0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1 0 %硫酸乙醇溶液,在105C加热至斑点显色淸晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；置紫外光灯（365nm)下检视，显相同的橙黄色荧光斑点。（5）菊花的理化鉴别取本品

24、1g，加石油醚（3060）20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1m1与乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取菊花对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录B）试验，吸取上述三种溶液各0.51l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸一冰醋酸一水（1：15：1：1：2）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾于，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。（6）山药

25、的理化鉴别取本品5g， 加二氯甲烷 30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干,残渣加二氯甲烷lml使溶解，作为供试品溶液。另取山药对照药材5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各知1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9:1 :0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在 105C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中 ，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。（7）茯苓的理化鉴别取本品1g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，虑过，取滤液作为供试品溶液。另取落新妇苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，

26、作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（13：32：9）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置5分钟后，置紫外灯下（365nm）下检视。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。（8）泽泻的理化鉴别 取本品2g，加乙酸乙酯20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液加于氧化铝柱（200300目，5g，内径为1cm，干法装柱）上，用乙酸乙酯10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为供试品溶液。另取23-乙酰泽泻醇B对照品，加乙酸乙酯制成每lm l含2mg的溶液

27、，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5u1，分别点于同一硅胶H 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5% 硅钨酸乙醇溶液，在105C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。参考文献：1ChP 2010 Vol (中国药典 2015 年版 一部)S . 2015:8201陈晖. RP-HPLC测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中马钱苷含量J. 中成药,2009,01:154-155. 2翟宏焱,颜晓航. 毛细管气相色谱法测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚的含量J. 安徽医药,2008,11:1043-1045. 3袁振营,陈洪英,王富丽. HPLC法测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚的含量J. 中国实验方剂学杂志,2001,04:16.