杞菊地黄丸浓缩丸的质量分析资料.docx
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杞菊地黄丸浓缩丸的质量分析资料
杞菊地黄丸（浓缩丸）的质量分析
实验仪器：
锥形瓶、5ml量瓶、50ml量瓶、量筒、高效液相色谱仪、UV2101PC紫外可见分光光度计、超声波振荡仪、紫外二极管阵列检测器、0.45μm微孔滤膜、紫外灯
实验试剂：
甲醇、甲酸、甲苯、乙醚、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、浓氨试液、重蒸馏水（临用前制备）、冰醋酸、环己烷、水饱和正丁醇、0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、盐酸盐5%三氯化铁乙醇溶液、5%硅钨酸乙醇溶液、0.1%的2,2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液、10%硫酸乙醇溶液、三氯化铝试液、10%磷钼酸乙醇溶液、2%香草醛硫酸乙醇溶液、十八烷基硅烷键合硅胶、中性氧化铝、PhenomenexC18、硅胶G薄层板、硅胶H薄层板、聚酰胺薄膜、
实验样品：
马钱苷对照品、丹皮酚对照品、知柏地黄丸（浓缩丸）、缺牡丹皮的杞菊地黄丸（浓缩丸）、23-乙酰泽泻醇B对照品、毛蕊花糖苷对照品、熊果酸对照品、绿原酸对照品、枸杞子对照药材、菊花对照药材、落新妇苷对照品、山药对照药材、
一、酒萸肉和牡丹皮的含量测定
（1）酒萸肉（酒萸肉又叫山茱萸,本品主要使用为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，酒萸肉提取物中主要含莫诺苷、马钱苷等成分。
）
方法1照高效液相色谱法（2015年版药典一部附录ⅥD）测定
1色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—乙腈—0.1%磷酸溶液（5：
9：
86）为流动相；检测波长为236nm。
理论板数按马钱苷峰计算应不低于4000。
2对照品溶液的制备
取马钱苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
3供试品溶液的制备
取本品适量，研碎，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，加在中性氧化铝柱（100～200目，4g，内径为1cm）上，用40%甲醇50ml洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4测定法
分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每1g含酒萸肉以马钱苷（C17H26O10）计，不得少于1.11mg。
方法2RP-HPLC法对杞菊地黄丸（浓缩丸）中马钱苷进行含量测定
1、色谱条件
色谱柱:
Diamonsil-C18（250mm×4.6mm,5μm）;流动相:
乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（10∶5∶85），（流动相对样品测定影响较大建议尝试四氢呋喃-乙腈-甲醇（1∶8∶4）-0.05%磷酸溶液比较）;流速:
1mL/min,检测波长:
236nm,柱温:
室温（柱温仅对保留时间有影响，对样品分离无影响，考虑到出峰时间，有的选择柱温为40℃，与2010年版《中国药典》一部一致。
）理论板数以马钱苷峰计算,不低于4000。
2、线性范围
2.1测定波长的选择取马钱苷对照品溶液，在含量测定条件下，以HPLC-DAD法进行紫外光谱全波长扫描测定，得到紫外吸收光谱图，最大吸收波长为238nm，参考《中国药典》2015年版一部明目地黄丸酒萸肉含量测定项下的检测波长，最后确定测定波长为236nm
2.2精密称取马钱苷对照品12.42mg,置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液,分别吸取对照品储备液1,3,5,7,10ml置50ml量瓶中,加85%甲醇至刻度,分别进样20μL,在236nm测定其峰面积,以峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线。
求回归方程
（参考结果：
Y=1033962.149X+3383.116,R=0.9996。
试验表明,进样量在0.0900～0.900μg范围内,马钱苷峰面积与进样量有良好线性关系。
）
2.3重复性试验
分别精密称取同一批号样品6份,用6个测定结果进行评价。
按样品测定项下的方法进行测定。
（参考结果其平均含量为1.17mg/g,RSD为1.1%,表明重复性较好。
）
2.4稳定性试验
考察对照品溶液、供试品溶液的稳定性。
精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μL,分别在制备后0,2,4,8h按样品测定项下的方法进行峰面积测定。
（参考结果：
计算峰面积,RSD分别为0.7%、0.6%,表明稳定性较好。
）
2.5加样回收率试验
精密称取同一批号样品6份,用6个测定结果进行评价。
精密加入马钱苷对照品溶液一定量,按样品测定项下的供试品溶液制备方法进行制备、测定,计算回收率。
2.6专属性试验
阴性对照样品除山茱萸外,其它七味药按生产工艺制成。
阴性对照溶液按供试品溶液制备方法制得,按样品测定项下方法进行测定。
2.7样品测定
取本品适量,研碎,取约1g,用85%甲醇20mL分3次（每次15min）超声振荡提取,滤过,弃去滤液,合并滤渣,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入85%甲醇50mL,密塞,称定重量,加热回流1h,放冷,再称定重量,用85%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,作为供试品溶液,每次进样20μL。
（参考结论：
通过改变其组成,发现在流动相乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（10∶5∶85）,马钱苷峰与其它成分有较好的分离,保留时间适中,效果良好。
85%的甲醇溶剂中马钱苷含量最高。
）
（2）牡丹皮
方法1牡丹皮薄层层析
取本品粉末5g,加乙醚,滤过,滤液挥干,残渣加丙酮1ml溶解作为供试品溶液。
同法制备阴性对照溶液。
另取丹皮酚对照品,加丙酮制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液,吸取上述三种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-醋酸乙酯（3:
1）为展开剂,展开,取出,晾干,喷以盐酸盐5%三氯化铁乙醇溶液,加热至斑点显色清晰。
在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
方法2现用高效液相色谱法测定
1条件
用C18柱,流动相为甲醇-水（55:
45）,检测波长为274nm,流速为1.0ml/min,柱温:
30℃。
结果丹皮酚进样量在0.7674μg～5.116μg范围内线性关系良好（r=0.9999）,平均加样回收率为103.3%（RSD=0.9%）。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为DiamonsilC185μm（200mm×4.6mm）色谱柱;流动相为甲醇-水（55∶45）;检测波长为274nm;流速为1.0ml/min;进样量为20μl。
柱温:
30℃。
理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5000。
2.2线性关系与考察
取丹皮酚对照品约15mg,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,用甲醇分别制成每1ml含丹皮酚38.37μg、63.59μg、76.74μg、127.90μg、153.48μg、255.80μg的对照品溶液,精密吸取上述溶液各20μl,在上述色谱条件下,分别进样5次,记录色谱图,以浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标,计算线性回归方程:
Y=6195274.2X+186908.8r=0.9999,结果表明丹皮酚在0.7674μg～5.116μg范围内呈良好的线性关系。
2.3精密度考察
精密吸取丹皮酚对照品溶液20μl,按上述色谱条件,重复进样5次,测定其峰面积值,结果丹皮酚峰面积的RSD为0.1%,表明测定方法的精密度良好。
2.4重现性考察
取同一批号的样品,照供试液制备方法平行制备5份供试品溶液,分别进样测定,记录峰面积。
结果含量的RSD为0.3%,表明测定方法的重复性良好。
2.5稳定性考察
取供试品溶液,于配制后第0、2、4、6、8小时分别进样测定,记录峰面积,丹皮酚峰面积的RSD为0.6%。
结果表明该溶液在8h内几乎无变化,可满足实验的要求。
2.6阴性对照试验
照处方比例制备缺牡丹皮的杞菊地黄丸（浓缩丸）,依照2.8项下操作,制备阴性供试液。
在上述色谱条件下,测定。
结果在丹皮酚的峰位上未出现色谱峰,说明阴性对照无干扰。
2.7加样回收试验
精密称取已知含量的样品5份,每份约1.5g,分别加入定量的丹皮酚对照品。
按“2.8”项下方法制备成供试品液,测定含量。
结果方法的加样回收率为103.3%,RSD=0.9%,表明方法准确度良好
2.8样品测定
取3g研细的样品,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声处理（功率120W,频率58KHz）45min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
方法3照高效液相色谱法（2015年版药典一部附录ⅥD）测定
1色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—水（70：
30）为流动相；检测波长为274nm。
理论板数按丹皮酚峰计算应不低于3500。
2对照品溶液的制备
取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。
3供试品溶液的制备
取本品适量，研碎，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率220W，频率25kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每1g含牡丹皮以丹皮酚（C9H10O3）计，不得少于1.1mg。
方法4HPLC波长切换技术同时测定
1实验条件
1.1提取方法的选择以50%甲醇溶液为溶剂，加热回流60min。
1.2检测波长的选择用紫外二极管阵列检测器在200～450nm范围内进行光谱扫描，结合液相色谱图，将波长设定为0～45min时采用检测波长240nm，46～65min时采用检测波长274nm
1.3流动相乙腈（A）－0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱。
2.方法与结果
2.1混合对照品溶液的制备
精密称取莫马钱苷和丹皮酚的对照品适量，用50%甲醇制成含马钱苷76.4μg·mL－1、丹皮酚98.2μg·mL－1的混合溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
取样品适量，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇检测波长:
在0～45min、240nm波长下检测马钱苷，在46～65min、274nm波长下检测丹皮酚。
加甲醇25mL，密塞，称量，加热回流1h，取出，放冷，再称量，用50%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3阴性样品溶液的制备
按照处方制备缺山茱萸（制）、知母、牡丹皮的阴性样品。
按“2.2”项下方法制备阴性样品溶液。
2.4色谱条件色谱柱:
PhenomenexC18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相:
乙腈（A）－0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5min，5%A→7%A;5～26min，、7%A;26～45min，7%A→20%A;45～55min，20%A→60%A;55～65min，60%A）;流速:
1mL·min－1;柱温:
40℃;检测波长:
在0～45min、240nm波长下检测马钱苷，在46～65min、274nm波长下检测丹皮酚。
2.5系统适用性试验
分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，在“2.4”项色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图。
2.6线性关系考察
精密称取混合对照品溶液1、3、6、10、15、20μL分别进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归。
（参考结果：
马钱苷进样量在0.0764～1.528μg，丹皮酚进样量在0.0982～1.964μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
）
2.7精密度试验
精密称取同一批杞菊地黄丸（浓缩丸），按“2.2”项下方法制备供试品溶液。
按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，每次进样10μL，测得马钱苷、丹皮酚峰面积的ＲSD（n=6）
2.8稳定性试验
精密称取同一批知柏地黄丸（浓缩丸），按“2.2”项下方法制备供试品溶液。
按“2.4”项下色谱条件分别在第0、3、6、9、12、15h进样10μL进行测定，测得马钱苷、丹皮酚峰面积的ＲSD（n=6）
2.9重复性试验
精密称取同一批知柏地黄丸（浓缩丸）粉末6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液。
按“2.4”项下色谱条件进样10μL进行测定，测得马钱苷、丹皮酚峰面积的ＲSD（n=6）
2.10准确度
精密称取已知含量的样品0.2g，共6份，分别置锥形瓶中，精密加入混合对照品的50%甲醇溶液（马钱苷15.28μg·mL－1，丹皮酚19.64μg·mL－1）25mL，按“2.2”项下方法制备加样供试溶液。
精密吸取对照品溶液与加样供试溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，测定回收率。
2、本品中枸杞子、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮等八味药的理化鉴别
（1）牡丹皮的理化鉴别
取本品lg，加乙醚10ml密塞,振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2ml使溶解，作为供试品溶液。
另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含2mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（4:
1:
0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），在105°C加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
（2）枸杞子的理化鉴别
取本品15g，研碎，加水100ml，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。
另取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照药材溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:
2:
1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点
（3）熟地黄的理化鉴别
取本品lg,加80%甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
另取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸（16:
0.5:
2）为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2,2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸渍，晾干。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。
（4）酒萸肉的理化鉴别
取本品0.5g,加乙酸乙酯10ml,超声处理15分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:
4:
0.5）为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105°C加热至斑点显色淸晰。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，显相同的橙黄色荧光斑点。
（5）菊花的理化鉴别
取本品1g，加石油醚（30～60℃）20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1m1与乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
另取菊花对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
再取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各0.5～1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯一乙酸乙酯一甲酸一冰醋酸一水（1：
15：
1：
1：
2）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾于，置紫外光灯（365nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
（6）山药的理化鉴别
取本品5g，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干,残渣加二氯甲烷lml使溶解，作为供试品溶液。
另取山药对照药材5g，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各知1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9:
1:
0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
（7）茯苓的理化鉴别
取本品1g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，虑过，取滤液作为供试品溶液。
另取落新妇苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（13：
32：
9）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置5分钟后，置紫外灯下（365nm）下检视。
供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
（8）泽泻的理化鉴别
取本品2g，加乙酸乙酯20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液加于氧化铝柱（200〜300目，5g，内径为1cm，干法装柱）上，用乙酸乙酯10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为供试品溶液。
另取23-乙酰泽泻醇B对照品，加乙酸乙酯制成每lml含2mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5u1，分别点于同一硅胶H薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（1:
1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硅钨酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
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