小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定.docx

1、小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定实验：小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定1：小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验背景资料过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析

2、出，最适温度为37，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。2、小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案:3. 实验目的熟悉并掌握生化四大技术离心、层析、比色、电泳。熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。4. 实验原理匀浆原理：分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶

3、解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存

4、在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。层析原理：凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混

5、合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。5. 结果比活（IU/mg）=酶活力/蛋白浓度总酶活力105=酶活力溶液体积匀浆酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度加入H2O2的ml数-2.5KMnO4 ml数KMnO4浓度/加入样品的ml数）105层析酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度加入H2O2的ml数-2.5KMnO4 ml数KMnO4浓度/加入

6、样品的ml数）3105回收率%=用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示IU定义：在规定条件下，每分钟催化1umol的【S】转变为【P】的酶量，为1IU。小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化溶液体积（ml）蛋白浓度（mg/ml）酶活Km分子量kD酶活力IU/ml总酶活IU比活（IU/mg）回收率%匀浆产物47127.251033.411056.041021.79盐析产物1.79透析产物层析产物1.51.125.071047.611044.531043.190.5891.72层析后蛋白吸光值变化曲线 SDS-PAGE图譜 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液【实验器材】1、动物：成年小鼠2、

7、器材：手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，10ml、50mL量筒，100mL烧杯，50mL锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4冰箱，纱布，滤纸 3、试剂：0.05mol/L醋酸-乙醇（23.5）缓冲液，pH4.0；氯仿【实验原理】：1）在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2）组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞 匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3）氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀4）离心：离心机 离心力 分离固液【实验步骤】1、 颈椎脱臼法处死小鼠（6只），

8、取肝脏（按6g计算，不称重）；2、 加入肝重8.5倍体积（51ml）的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5乙醇，），用组织捣碎机匀浆1-3min（三组合并一块匀浆，快慢交替使用）。【留样】不离心，取200ul匀浆液留样，放-20oC保存。3、 冰浴下缓慢滴加肝重0.5倍体积（3ml）的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆30s-1min；匀浆液离心，4，7500rpm，30min后，弃沉淀，收获上清液约44ml于100ml锥形瓶中。4、 取匀浆后上清液120uL，加入40 uL 4电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20冰箱保存。【留样

9、】另取200 uL匀浆后上清液-20冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶【实验器材】1、100mL锥形瓶，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD-20KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管2、试剂：0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl），50%甘油。【实验原理】：1）在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程2）盐酸沉淀原理 ： 中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而

10、沉淀析出3）透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子的一种分离纯化技术【实验步骤】1、 冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h（用玻璃棒手动搅拌）；2、 将盐析溶液离心（40C，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀；3、 用肝重4倍体积（24ml）的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min ，离心（40C 5000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液；4、 【留样】取盐析后上清样品120ul，用40 uL 4电泳上样Buffer制样

11、，煮3-5min，备用于SDS-PAGE检测，-20冰箱保存。5、 将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用6、 将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内（注意封口要结实），置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液，上清液的10倍体积）中透析两周，中途更换一次透析液（7、 两周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（40C，7500rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀；8、 用2mL3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶）， 离心（40

12、C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。9、 【留样】取上清样品120ul，用40 uL 4电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测。放置-20冰箱保存。10、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用；11、 将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于75%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至11.2ml收样，放置-20冰箱保存。（三）凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶【实验器材】1、玻璃层析柱（直径1.8cm长45cm）、细乳胶管、夹子、玻璃棉或棉花、细玻璃棒、收集管（试管）、试管架、

13、紫外可见分光光度计（型号-9100）、锥形瓶、吸量管、滴管。2、试剂：sephadexG-200，0.1mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液【实验原理】根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。【实验步骤】1、 凝胶的处理：每组取2.5g sephadexG-200葡聚糖凝胶干粉（膨胀体积3040mL/每克干胶），浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.8) 继续浸泡一天2、 装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫，越薄越好。将层析柱垂直夹于铁架上，层析柱下端

14、的止水夹夹紧，向柱中加入约 5-7cm 高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60ml）时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液。3、 平衡：打开层析柱出口，控制流速为0.30.5mL/min (约5-10滴/min，不要超速)，用磷酸盐缓冲液

15、(0.1mol/L，pH7.8)流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。4、 浓缩样品 5、 加样：打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液1-1.2ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。6、 洗脱：洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液(0

16、.1mol/L，pH7.8)，保持0.30.5mL/min的流速。洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。7、 收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，每管收集1mL（约20滴）。收集管依次在407nm和280nm波长下，以空气调零，测定各管吸光度值。以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。8、 收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280 nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物（此次测定以缓冲液调零）。9、 【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置-20冰箱保存。10、【留样】取层析纯化样品60uL（浓不浓缩

17、视情况而定），用20 uL 4电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5min，备用于SDS-PAGE检测，放置-20冰箱保存。（四）Lowry法测定纯化的过氧化物酶浓度【实验器材】1） 试剂A: 2g 酒石酸钾钠及100g Na2CO3 溶于 500ml 1.0mol/L NaOH 中，用水稀释至1000ml.2） 试剂 B: 2g酒石酸钾钠及1g CuSO4 5H20分别溶于少量水中，混合后加水至90ml再加1mol/L NaOH 10ml 即成。3） 试剂 C: 市售的酚试剂 1：15 稀释， 最后浓度为 0.150.18mol/L(用标准NaOH 滴定)。试制AB 在临用前配制。称取Na2

18、WO42H20 100g 及Na2MoO42H20 25g 溶于700ml蒸馏水中，加入 85% H3PO4 50ml、浓HCl 100ml，混匀后，置圆底烧瓶中加热回流10小时，加入Li2SO4H20 150g、蒸馏水50ml及溴水（Br2）数滴，溶液变为红黄色，置通风厨内加热沸腾15分钟蒸发Br2 ,溶液呈透明的金黄色，冷却后加蒸馏水定容至1000ml,过滤，置棕色瓶中保存，用标准NaOH标定其浓度，应用时用蒸馏水稀释至浓度为0.150.18mol/L. 溶液中的硫酸锂能防止磷钼酸沉淀，溴可以氧化试剂中的还原物质，使其不致干扰显色。4） 标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种

19、球蛋白10mg,用生理盐水配制成0.1mg/ml的标准蛋白溶液。5） 生理盐水。【实验原理】：酪氨酸与酚试剂产生蓝色化合物，颜色深浅与蛋白质含量成正比。【实验步骤】1.制作标准曲线不同浓度的标准蛋白组配置 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液（0.1mg/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 生理盐水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂AB（9:1）混合液（ml） 1 1 1 1 1 1 混匀后置于50水浴10分钟，冷却 试剂C（ml） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 立即混匀，置于50水浴保温20分钟，冷却后比色 1）按照上表配成不同浓度的

20、标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光光度计上测定 650nm处的光密度值。2）以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。2.样品蛋白的测定，按下表操作样品蛋白的测定 匀浆稀释200倍 匀浆稀释1500倍 层析稀释5倍 层析稀释10倍 空白管 稀释的待测样品 1.0 1.0 1.0 1.0 （ml） 生理盐水（ml） 1.0 试剂AB（9:1）混合液（ml） 1 1 1 1 1 混匀后在50水浴保温10分钟，冷却 试剂C（ml） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 立即混匀，置50水浴保温20分钟，冷却后测定650nm波长处的光密度值。查标准曲线计算待测样

21、品的蛋白含量，以g/L为单位。 【备注】：1.待测样品：层析后的纯化样品。 2.样品稀释倍数：需预作后确定，根据层析后样品在280nm下的吸光值（应大于0.2以上）。 3.标准蛋白：为浓度0.2mg/ml的牛血清白蛋白溶液，按操作绘制相应标准曲线用于样品浓度（匀浆产物约稀释200或400倍两个点，层析产物稀释5-10倍）测定。（五）双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数【实验原理】：1、V=Vmaxs/Km+s 1/V=Kmax/Vmaxs+1/Vmax2、2H2O2=2H 2O+O2(反应学原理)2MnSO4 + K2SO4+5O2+8H 2O剩余的用 KMnO4 滴定：2KMnO4+5H2

22、O2+3H2SO4=2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O(方法学原理)在酸性环境下（硫酸）紫红色变为滴定终点的微红色，记录滴定用的 ml 数，取平均值 计算 H2O2 的准确摩尔浓度。求出反应前后的浓度差及反应的速度（V） ，以 1/s为 横坐标，1/V 为纵坐标作图可求出酶的 H2O2Km 值 【实验步骤】步骤一：将样品稀释（匀浆产物稀释1000倍、层析产物稀释3000倍），进行酶活的测定步骤二1.H2O2 的浓度的再标定：取清洁锥形瓶2只，各加0.04mol/L的H2O2 溶液2.0ml 和25% H2SO4 2.0ml。分别用0.002mol/L KMnO4 滴定至微红，记录滴定毫

23、升数，取平均值，计算H2O2 的摩尔浓度。2.取层析产物， 用Ph7.0 、0.2mol/L 磷酸缓冲液稀释，制得的稀释层析产物浓度为1:3000。反应测速：取干燥的50ml锥形瓶5只，编号后按下表操作：所加试剂（ml）12345H2O2 溶液2.502.001.501.000.50蒸馏水00.501.001.502.001：3000层析产物0.500.500.500.500.50要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀，记录室温。蒸馏水的作用是配平各锥形瓶中物质的体积。终止反应：血液加入后立即计时10分钟，到时立即加入25% H2SO4 2.0ml，边加边摇，终止酶促反应。3.滴定 用标准0.00

24、2mol/L KMnO4 滴定， 记录各瓶耗KMnO4 的ml 数。4.计算1反应瓶中H2O2 浓度计算。2反应速度的计算3求Km值【备注】1、 待测样品：层析后的纯化样品。2、样品稀释倍数：将样品稀释（匀浆产物稀释5倍、层析产物稀释3000-3500倍），按操作流程用量进行酶活、Km值测定。 （六）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量【实验原理】：1、电泳：带点粒子在电场中的泳动 条件：带电粒子 、电场 、介质 影响因素：1）电场强度 2）带电粒子情况 3)带电粒子形状 4）带电粒子分子量 2、SDS-PAGE：上样缓冲液的成分 1）溴酚蓝：指示剂 2）油：比重剂 3）-巯基乙醇：破

25、坏蛋白二硫键 4）SDS：破坏蛋白氢键和疏水键 3、测分子量：lgMW=A-BRf Rf=过氧化氢酶的迁移率/溴酚蓝的迁移率【实验步骤】1、凝胶的制备（由实验室老师完成，包括装板、配胶、凝胶液的灌注和聚合） 2、蛋白质样品的处理：将样品放在沸水中煮沸 5min3、加样：在垂直板型电泳装置的两个槽内加电极缓冲液，必须使缓冲液高于电极，然 后用微量注射器分别在各个样品槽中加样，匀浆液加 15ul，盐析液和透析液加 30ul 4、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始电流控制在 15-20mA 电 泳 15min 后再升到 50mA,保持电流强度不变， 待指示剂溴酚蓝迁移至下沿约 1-1

26、.5cm 处，停止电泳，需 h 5、剥胶和固定：电泳结束后取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入 凝胶柱与玻璃管内壁之间，轻轻旋转玻璃管，一面注入蒸馏水，一面推针呈旋转式 前进，是凝胶柱与管壁脱离 6、染色：将凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮兰 R-250，40%甲醇和 10%的冰醋酸）中， 染色 0.5h，弃去染色液 7、脱色：加入脱色液（10%甲醇和 10%的冰醋酸） ，脱色 1-3h，期间更换 2-3 次脱色液， 然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚后为止 8、测量和数据处理1.待测分子量蛋白质与另一系列已知分子量的蛋白质在同一条件，同一凝胶中进行电泳分离，得到区带清晰的

27、电泳图谱后，先从分离胶上端为起点测量各蛋白质的迁移距离，以及指示染料溴粉蓝（BPB）的迁移距离。然后计算出各蛋白质的相对迁移率：相对迁移率= 样品迁移距离 BPB的迁移距离2.以标准蛋白质的对数为纵坐标，相对迁移率为横坐标作图，得到标准曲线。3.用待测蛋白质的相对迁率，从标准曲线上查出其分子量【备注】1、 待测样品：匀浆后样品、盐析后样品、透析后样品、层析后最终样品。2、 样品上样量：采用4电泳上样Buffer，各样品均上样20-30ul。标准蛋白Marker上样10ul。实验数据Km值的测定项目12345加入H2O2的ml数2.521.510.5KMnO4的用量（ml）1.41.10.50.

28、40.2加入H2O2的mmol数0.03650.091 0.073 0.055 0.037 0.018 剩余H2O2的mmol数0.0022.50.0070.00550.00250.0020.001反应速度-0.084 0.068 0.052 0.035 0.017 底物浓度30.030 0.024 0.018 0.012 0.006 1/v=111.869 14.815 19.139 28.986 57.971 1/【S】=132.877 41.096 54.795 82.192 164.384 层析产物的Km值为：0.589酶活的测定12稀释的匀浆液（ml）0.5稀释的层析液（ml）0.5

29、加入的H2O2的ml数2.52.5加入KMnO4的ml数1118.5匀浆产物的酶活为：7.25103IU/ml匀浆产物的总酶活为: 3.63103IU/ml匀浆产物的比活为：6.04102 IU/mg层析产物的酶活为：5.07104IU/ml层析产物的总酶活为：8.45103IU/ml层析产物的比活为：4.53104 IU/mgLowry法测定纯化的过氧化氢物浓度标准蛋白匀浆产物层析产物管号12345678910吸光值00.0920.1900.2900.3680.4650.1690.0350.3910.285匀浆稀释200倍的蛋白浓度为：0.0790mg/ml匀浆稀释500倍的蛋白浓度为：0.0164 mg/ml层析稀释5的蛋白浓度为：0.183 mg/ml层析稀释10的蛋白浓度为：0.133 mg/mlSDSPAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量Maker分子量94.066.245.033.026.020.014.4位移2.22.42.83.03.33.43.6BPB的相对位移：4.4cm匀浆后样品蛋白的相对位移：2.5cm盐析后样品蛋白的相对位移：2.5cm层析后样品蛋白的相对位移：2.6cm匀浆产物的分子量为：1.79kD盐析产物的分子量为：1.79kD层析产物的分子量为：1.72 kD层析后蛋白吸光度变化12345678910OD280nm0.3270.3050.359