小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定.docx

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小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定

实验：

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

1：

《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料

过氧化氢酶（Catalase）是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2对细胞的危害。

人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。

溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。

本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。

2、《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验方案:

3.实验目的

熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。

熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。

4.实验原理

匀浆原理：

分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。

过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。

过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。

根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。

盐析原理：

蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。

通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态,离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

透析原理：

采用20%乙醇、0.1mol/LpH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/LNaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。

在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。

透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。

选择0.1mol/LpH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

层析原理：

凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。

采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。

5.结果

比活（IU/mg）=酶活力/蛋白浓度

总酶活力105=酶活力×溶液体积

匀浆酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度×加入H2O2的ml数-2.5×KMnO4ml数×KMnO4浓度/加入样品的ml数）×105

层析酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度×加入H2O2的ml数-2.5×KMnO4ml数×KMnO4浓度/加入样品的ml数）×3×105

回收率%=用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示

IU定义：

在规定条件下，每分钟催化1umol的【S】转变为【P】的酶量，为1IU。

小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化

溶液体积（ml）

蛋白浓度（mg/ml）

酶活

Km

分子量

kD

酶活力

IU/ml

总酶活IU

比活

（IU/mg）

回收率%

匀浆产物

47

12

7.25×103

3.41×105

6.04×102

1.79

盐析产物

1.79

透析产物

层析产物

1.5

1.12

5.07×104

7.61×104

4.53×104

3.19

0.589

1.72

层析后蛋白吸光值变化曲线

SDS-PAGE图譜

（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

【实验器材】

1、动物：

成年小鼠

2、器材：

手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，10ml、50mL量筒，100mL烧杯，50mL锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4℃冰箱，纱布，滤纸

3、试剂：

0.05mol/L醋酸-乙醇（23.5％）缓冲液，pH4.0；氯仿

【实验原理】：

1）在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧

2）组织匀浆法:

机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:

pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质）

3）氯仿;Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀

4）离心：

离心机离心力分离固液

【实验步骤】

1、颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏（按6g计算，不称重）；

2、加入肝重8.5倍体积（51ml）的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L,pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇，），用组织捣碎机匀浆1-3min（三组合并一块匀浆，快慢交替使用）。

【留样】不离心，取200ul匀浆液留样，放-20oC保存。

3、冰浴下缓慢滴加肝重0.5倍体积（3ml）的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆30s-1min；匀浆液离心，4℃，7500rpm，30min后，弃沉淀，收获上清液约44ml于100ml锥形瓶中。

4、取匀浆后上清液120uL，加入40uL4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。

【留样】另取200uL匀浆后上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。

（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶

【实验器材】

1、100mL锥形瓶，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD-20KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管

2、试剂：

0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/LpH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/L

pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl），50%甘油。

【实验原理】：

1）在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程

2）盐酸沉淀原理：

中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出

3）透析:

利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子的一种分离纯化技术

【实验步骤】

1、冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5MNa2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h（用玻璃棒手动搅拌）；

2、将盐析溶液离心（40C，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀；

3、用肝重4倍体积（24ml）的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min，离心（40C5000rpm,10min）后，弃去沉淀，保留上清液；

4、【留样】取盐析后上清样品120ul，用40uL4×电泳上样Buffer制样，煮3-5min，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。

5、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用

6、将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内（注意封口要结实），置于透析液（20%乙醇，0.1mol/LpH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液，上清液的10倍体积）中透析两周，中途更换一次透析液（7、两周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（40C，7500rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀；

8、用2mL~3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶），离心（40C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。

9、【留样】取上清样品120ul，用40uL4×电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测。

放置-20℃冰箱保存。

10、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用；

11、将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于75%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至1~1.2ml收样，放置-20℃冰箱保存。

（三）凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶

【实验器材】

1、玻璃层析柱（直径1.8cm长45cm）、细乳胶管、夹子、玻璃棉或棉花、细玻璃棒、收集管（试管）、试管架、紫外\可见分光光度计（型号-9100）、锥形瓶、吸量管、滴管。

2、试剂：

sephadexG-200，0.1mol/LpH7.8磷酸盐缓冲液

【实验原理】

根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。

【实验步骤】

1、凝胶的处理：

每组取2.5gsephadexG-200葡聚糖凝胶干粉（膨胀体积30~40mL/每克干胶），浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）继续浸泡一天2、装柱：

取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫，越薄越好。

将层析柱垂直夹于铁架上，层析柱下端的止水夹夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。

当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60ml）时为止。

关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。

如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。

凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液。

3、平衡：

打开层析柱出口，控制流速为0.3~0.5mL/min（约5-10滴/min，不要超速），用磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）流洗平衡20min。

凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。

4、浓缩样品5、加样：

打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。

用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液1-1.2ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。

打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。

待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。

6、洗脱：

洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.8），保持0.3~0.5mL/min的流速。

洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。

7、收集及检测：

样品进胶开始，用试管收集流出液，每管收集1mL（约20滴）。

收集管依次在407nm和280nm波长下，以空气调零，测定各管吸光度值。

以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。

8、收获纯化产物：

合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物（此次测定以缓冲液调零）。

9、【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置-20℃冰箱保存。

10、【留样】取层析纯化样品60uL（浓不浓缩视情况而定），用20uL4×电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5min，备用于SDS-PAGE检测，放置-20℃冰箱保存。

（四）Lowry法测定纯化的过氧化物酶浓度

【实验器材】

1）试剂A:

2g酒石酸钾钠及100gNa2CO3溶于500ml1.0mol/LNaOH中，用水稀释至1000ml.

2）试剂B:

2g酒石酸钾钠及1gCuSO4•5H20分别溶于少量水中，混合后加水至90ml再加1mol/LNaOH10ml即成。

3）试剂C:

市售的酚试剂1：

15稀释，最后浓度为0.15~0.18mol/L（用标准NaOH滴定）。

试制AB在临用前配制。

称取Na2WO4•2H20100g及Na2MoO4•2H2025g溶于700ml蒸馏水中，加入85%H3PO450ml、

浓HCl100ml，混匀后，置圆底烧瓶中加热回流10小时，加入Li2SO4•H20150g、蒸馏水50ml及溴水（Br2）数滴，溶液变为红黄色，置通风厨内加热沸腾15分钟蒸发Br2,溶液呈透明的金黄色，冷却后加蒸馏水定容至1000ml,过滤，置棕色瓶中保存，用标准NaOH标定其浓度，应用时用蒸馏水稀释至浓度为0.15~0.18mol/L.

溶液中的硫酸锂能防止磷钼酸沉淀，溴可以氧化试剂中的还原物质，使其不致干扰显色。

4）标准蛋白溶液：

称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg,用生理盐水配制成0.1mg/ml的标准蛋白溶液。

5）生理盐水。

【实验原理】：

酪氨酸与酚试剂产生蓝色化合物，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

【实验步骤】

1.制作标准曲线

不同浓度的标准蛋白组配置

123456

标准蛋白溶液（0.1mg/ml）00.20.40.60.81.0生理盐水（ml）1.00.80.60.40.20试剂AB（9:

1）混合液（ml）111111混匀后置于50℃水浴10分钟，冷却

试剂C（ml）3.03.03.03.03.03.0立即混匀，置于50℃水浴保温20分钟，冷却后比色

1）按照上表配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光光度计上测定650nm处的光密度值。

2）以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。

2.样品蛋白的测定，按下表操作

样品蛋白的测定

匀浆稀释200倍匀浆稀释1500倍层析稀释5倍层析稀释10倍空白管

稀释的待测样品1.01.01.01.0—

（ml）

生理盐水（ml）————1.0试剂AB（9:

1）

混合液（ml）11111混匀后在50水浴保温10分钟，冷却试剂C（ml）3.03.03.03.03.0立即混匀，置50℃水浴保温20分钟，冷却后测定650nm波长处的光密度值。

查标准曲线计算待测样品的蛋白含量，以g/L为单位。

【备注】：

1.待测样品：

层析后的纯化样品。

2.样品稀释倍数：

需预作后确定，根据层析后样品在280nm下的吸光值（应大于0.2以上）。

3.标准蛋白：

为浓度0.2mg/ml的牛血清白蛋白溶液，按操作绘制相应标准曲线用于样品浓度（匀浆产物约稀释200或400倍两个点，层析产物稀释5-10倍）测定。

（五）双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数

【实验原理】：

1、V=Vmax［s］/Km+［s］1/V=Kmax/Vmax［s］+1/Vmax

2、2H2O2=2H2O+O2（反应学原理）

2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O

剩余的用KMnO4滴定：

2KMnO4+5H2O2+3H2SO4=2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O（方法学原理）

在酸性环境下（硫酸）紫红色变为滴定终点的微红色，记录滴定用的ml数，取平均值计算H2O2的准确摩尔浓度。

求出反应前后的浓度差及反应的速度（V），以1/［s］为横坐标，1/V为纵坐标作图可求出酶的H2O2Km值

【实验步骤】

步骤一：

将样品稀释（匀浆产物稀释1000倍、层析产物稀释3000倍），进行酶活的测定

步骤二

1.H2O2的浓度的再标定：

取清洁锥形瓶2只，各加0.04mol/L的H2O2溶液2.0ml和25%H2SO42.0ml。

分别用0.002mol/LKMnO4滴定至微红，记录滴定毫升数，取平均值，计算H2O2的摩尔浓度。

2.取层析产物，用Ph7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液稀释，制得的稀释层析产物浓度为1:

3000。

反应测速：

取干燥的50ml锥形瓶5只，编号后按下表操作：

所加试剂（ml）

1

2

3

4

5

H2O2溶液

2.50

2.00

1.50

1.00

0.50

蒸馏水

0

0.50

1.00

1.50

2.00

1：

3000层析产物

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

要求：

试剂加入准确而迅速，立即摇匀，记录室温。

蒸馏水的作用是配平各锥形瓶中物质的体积。

终止反应：

血液加入后立即计时10分钟，到时立即加入25%H2SO42.0ml，边加

边摇，终止酶促反应。

3.滴定用标准0.002mol/LKMnO4滴定，记录各瓶耗KMnO4的ml数。

4.计算

1反应瓶中H2O2浓度计算。

2反应速度的计算

3求Km值

【备注】1、待测样品：

层析后的纯化样品。

2、样品稀释倍数：

将样品稀释（匀浆产物稀释5倍、层析产物稀释3000-3500倍），按操作流程用量进行酶活、Km值测定。

（六）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量

【实验原理】：

1、电泳：

带点粒子在电场中的泳动条件：

带电粒子、电场、介质影响因素：

1）电场强度2）带电粒子情况3）带电粒子形状4）带电粒子分子量2、SDS-PAGE：

上样缓冲液的成分1）溴酚蓝：

指示剂2）油：

比重剂3）β-巯基乙醇：

破坏蛋白二硫键4）SDS：

破坏蛋白氢键和疏水键3、测分子量：

lgMW=A-BRfRf=过氧化氢酶的迁移率/溴酚蓝的迁移率

【实验步骤】

1、凝胶的制备（由实验室老师完成，包括装板、配胶、凝胶液的灌注和聚合）2、蛋白质样品的处理：

将样品放在沸水中煮沸5min

3、加样：

在垂直板型电泳装置的两个槽内加电极缓冲液，必须使缓冲液高于电极，然后用微量注射器分别在各个样品槽中加样，匀浆液加15ul，盐析液和透析液加30ul4、电泳：

上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始电流控制在15-20mA电泳15min后再升到50mA,保持电流强度不变，待指示剂溴酚蓝迁移至下沿约1-1.5cm处，停止电泳，需h5、剥胶和固定：

电泳结束后取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶柱与玻璃管内壁之间，轻轻旋转玻璃管，一面注入蒸馏水，一面推针呈旋转式前进，是凝胶柱与管壁脱离6、染色：

将凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮兰R-250，40%甲醇和10%的冰醋酸）中，染色0.5h，弃去染色液7、脱色：

加入脱色液（10%甲醇和10%的冰醋酸），脱色1-3h，期间更换2-3次脱色液，然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚后为止8、测量和数据处理

1.待测分子量蛋白质与另一系列已知分子量的蛋白质在同一条件，同一凝胶中进行电泳分离，得到区带清晰的电泳图谱后，先从分离胶上端为起点测量各蛋白质的迁移距离，以及指示染料溴粉蓝（BPB）的迁移距离。

然后计算出各蛋白质的相对迁移率：

相对迁移率=样品迁移距离

BPB的迁移距离

2.以标准蛋白质的对数为纵坐标，相对迁移率为横坐标作图，得到标准曲线。

3.用待测蛋白质的相对迁率，从标准曲线上查出其分子量

【备注】

1、待测样品：

匀浆后样品、盐析后样品、透析后样品、层析后最终样品。

2、样品上样量：

采用4×电泳上样Buffer，各样品均上样20-30ul。

标准蛋白Marker上样10ul。

实验数据

Km值的测定

项目

1

2

3

4

5

①加入H2O2的ml数

2.5

2

1.5

1

0.5

②KMnO4的用量（ml）

1.4

1.1

0.5

0.4

0.2

③加入H2O2的mmol数①×0.0365

0.091

0.073

0.055

0.037

0.018

剩余H2O2的mmol数

×0.002×2.5

0.007

0.0055

0.0025

0.002

0.001

⑤反应速度③-

0.084

0.068

0.052

0.035

0.017

⑥底物浓度③÷3

0.030

0.024

0.018

0.012

0.006

⑦1/v=1÷⑤

11.869

14.815

19.139

28.986

57.971

⑧1/【S】=1÷⑥

32.877

41.096

54.795

82.192

164.384

层析产物的Km值为：

0.589

酶活的测定

1

2

稀释的匀浆液（ml）

0.5

—

稀释的层析液（ml）

—

0.5

加入的H2O2的ml数

2.5

2.5

加入KMnO4的ml数

11

18.5

匀浆产物的酶活为：

7.25×103IU/ml

匀浆产物的总酶活为:

3.63×103IU/ml

匀浆产物的比活为：

6.04×102IU/mg

层析产物的酶活为：

5.07×104IU/ml

层析产物的总酶活为：

8.45×103IU/ml

层析产物的比活为：

4.53×104IU/mg

Lowry法测定纯化的过氧化氢物浓度

标准蛋白

匀浆产物

层析产物

管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

吸光值

0

0.092

0.190

0.290

0.368

0.465

0.169

0.035

0.391

0.285

匀浆稀释200倍的蛋白浓度为：

0.0790mg/ml

匀浆稀释500倍的蛋白浓度为：

0.0164mg/ml

层析稀释5的蛋白浓度为：

0.183mg/ml

层析稀释10的蛋白浓度为：

0.133mg/ml

SDS—PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量

Maker分子量

94.0

66.2

45.0

33.0

26.0

20.0

14.4

位移

2.2

2.4

2.8

3.0

3.3

3.4

3.6

BPB的相对位移：

4.4cm

匀浆后样品蛋白的相对位移：

2.5cm

盐析后样品蛋白的相对位移：

2.5cm

层析后样品蛋白的相对位移：

2.6cm

匀浆产物的分子量为：

1.79kD

盐析产物的分子量为：

1.79kD

层析产物的分子量为：

1.72kD

层析后蛋白吸光度变化

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

OD280nm

0.327

0.305

0.359