全国病媒生物抗药性监测方案4.docx

全国病媒生物抗药性监测方案4.docx

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全国病媒生物抗药性监测方案4

全国重要病媒生物抗药性监测（试行）方案

根据卫生部《2007年卫生应急工作要点》中“提高卫生应急能力”的精神，和卫生部发布的2007年卫生工作要点中“大力开展爱国卫生运动”的要求，落实中国疾病预防控制中心的关于重要病媒生物年度工作计划，特制定本方案。

方案的实施能够指导和推进“十一五”期间我国重要病媒生物控制水平、提升突发公共卫生事件中病媒生物控制技术支撑水平、规范我国重要病媒生物抗药性监测方法。

抗药性是影响全球公共卫生、农业、林业、畜牧业等领域中有害生物控制的重要问题，是影响媒介生物性传染病疾病预防控制的关键因素。

抗药性的产生和发展与药剂的使用有非常密切的关系。

开展和加强重要病媒生物抗药性监测，可以指导化学药剂的科学合理使用，提高控制效果，延缓抗药性发展速度，减少人畜中毒事件的发生，保护有益生物，维持生态平衡。

1背景

1.1抗药性监测在疾病预防控制中的重要性

目前，我国登革热、疟疾、鼠疫、肾综合征出血热、肠道传染病（如霍乱、细菌性痢疾）等疫区处理中，化学控制是其媒介生物控制的主要措施。

通过对常用化学药剂的敏感性调查和抗药性动态监测，可以选择并储备适宜的控制药剂，针对疫情种类、疫区的病媒生物种类、疫情的发生季节和生境等背景材料制定“病媒生物应急控制预案”，提高我国在传染病预防控制中病媒生物控制能力。

1.2抗药性概况

据统计，全球几乎所有病媒生物（如蚊类、蝇类、鼠类、蚤类等）都有产生抗药性的报道。

据统计，全世界已经有90种蚊虫对一种或几种杀虫剂产生抗性，其中按蚊51种、库蚊20种、伊蚊19种。

51种按蚊中，对DDT产生抗性的有49种，有机磷抗性24种，氨基甲酸酯14种，拟除虫菊酯10种。

产生抗性的库蚊有20种。

家蝇的抗药性问题在我国十分突出，对DDT、六六六等有机氯类，对敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、毒死蜱等有机磷类，对残杀威等有机磷类，对二氯苯醚菊酯、胺菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等拟除虫菊酯类药剂，都已经产生了不同程度的抗药性。

1978年，全国蚊虫抗性调查显示：

淡色库蚊对有机氯类杀虫剂产生抗性，且无明显的区域性差异；淡色库蚊对有机磷类杀虫剂抗性在我国的东部高于西部。

中华按蚊对DDT的抗性现象发生普遍。

在1984-1986年的调查显示，淡色库蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂普遍产生抗性。

在二十世纪90年代，淡色库蚊对溴氰菊酯的抗药性趋势显示，东南沿海高于华北和东北，城市高于农村。

目前，淡色库蚊、白纹伊蚊、家蝇、中华按蚊、三带喙库蚊在我国多数地区已经产生了不同程度的抗药性，印鼠客蚤在广东省、云南省产生抗药性，褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠在我国的多数分布区也对抗凝血剂产生抗性。

鉴于目前媒介生物性传染病发生的严峻形势，必须加强我国主要病媒生物抗药性监测工作。

1.3抗药性监测的基础条件

1.3.1疫情控制的需要

媒介生物性传染病占我国法定传染病的1/3，控制病媒是控制这类疾病的有效措施之一，化学药剂是快速降低媒介密度的必须手段，其依据是控制预案。

了解当地病媒对常用化学药剂的敏感程度、掌握有效药剂种类及其使用技术、制定针对性的控制预案，以应对可能出现的疫情。

1.3.2人民生活和社会与经济的需要

随着社会和经济的发展，人们的健康意识增强。

控制能够影响人类健康和生活的病媒生物，倍受各界人士的关注。

无论在大型活动（如奥运会、亚运会、世博会等）、大型工程（如三峡工程、南水北调、青藏铁路等），还是在市民群众的出游和日常生活中，对公共卫生要求更高，对环境保护的意识更强，这些都要求我们既要控制有害生物，又要绿色环保，抗药性调查可以使我们科学用药、少用药。

1.3.3已有的工作基础

由于病媒生物控制在我国疾病预防控制中的重要作用，国家对此非常重视，全国爱国卫生委员会是我国的病媒生物控制的积极推动者，在此平台上开展了一系列工作，如于二十世纪70年代末进行的全国蚊、蝇、鼠的抗药性监测，在全国范围广泛进行，基本摸清了当时的抗药性现状和发展动态，奠定了抗药性监测的理论基础和本底资料，同时也培养了大量的专业技术人员。

针对重要媒介生物性传染病和具有严重骚扰性的媒介，进行抗药性调查。

调查以WHO的测定方法为基础，统一检测方法，成果与信息共享。

与此同时，也进行抗性机制、抗性遗传规律、抗药性治理策略等的研究，对我国疾病预防控制和环境卫生的改善起到积极作用。

另外，在全国重要病媒生物监测正在运行，在该平台的支持下，使对抗药性的监测网络化成为可能，可以利用已有的人才、物资和系统资源，丰富各级疾控系统的病媒生物预防控制工作，为了实现病媒生物可持续控制，提高疾控能力。

1.4当前抗药性监测中存在的问题

1.4.1专业技术人员缺乏

二十世纪90年代，由于工作经费紧张和工作重心的转移，全国抗药性协作中断，使一些从事抗药性监测的专业技术人员离开原工作岗位，使病媒生物控制的发展受到极大损失。

1.4.2测定方法不统一

抗药性的检测和研究，主要集中在各级疾控机构、研究所、大学等领域，通过对近20多年发表的文献统计，出现试验方法不一致，即使相同的方法，试验条件不同、试虫不统一、供试药剂各异、死亡率判断标准不一致、数据统计方法各异等现象，致使获得资料间可比性差，不能实现资料的共享。

1.4.3抗药性监测结果的利用率低

对病媒生物的监测是为了指导用药，科学合理用药，进而制定抗性治理方案、疫情控制预案，最终为疾病预防控制提供理论依据。

由于抗药性的发生有区域性，不同的病媒生物、不同的药剂类型其抗性机制不同，只有充分利用抗药性监测和研究的结果，实现成果共享，才能提供资料的利用率，更好地为疾控服务。

2监测目的

2.1掌握抗药性水平，指导防制

掌握我国重要病媒生物对主要化学药剂的抗性水平，了解抗性动态和发展规律。

2.2制定控制预案，提高疾控能力

为病媒生物控制中药剂的选择和使用提供科学依据；针对不同疫情、不同地区、不同病媒生物制定药剂的储备和使用预案。

3监测的组织、分工和职责

3.1监测网络

以中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室为依托，以各省（自治区，直辖市）为监测试点单位，监测点由监测试点设立。

3.2分工和职责

3.2.1中国疾病预防控制中心传染病所

负责《全国重要病媒生物抗药性监测方案》（以下简称《方案》）的制定、组织、协调和督导；承担抗药性监测的技术指导和培训，提供监测药剂的标准样品，负责监测信息的收集、整理、分析、总结和反馈；并进行监测工作的督查和质量控制。

3.2.1省（自治区，直辖市）疾病预防控制部门

按照《方案》要求，落实开展辖区内监测工作；确定一名主管领导负责协调，督促检查监测方案落实；按时上报、分析监测结果。

4监测内容和方法

4.1蚊虫抗药性监测

4.1.1靶标蚊虫及监测点的选择

淡色库蚊/致倦库蚊（幼虫）、中华按蚊（成虫）、白纹伊蚊（幼虫）为监测对象。

各监测试点选择依据：

（1）当地媒介生物性传染病的发生情况；

（2）相关疾病媒介生物的种类和发生强度；（3）病媒生物对人的骚扰程度等选择。

监测点要考虑地理分布（经纬度、生境），每省选两个监测点进行。

监测点要相对固定。

4.1.2监测时间

在当地的发生高峰期，每年进行一次，年度间的测定时间相对固定。

4.1.3试虫采集

淡色库蚊：

雌成蚊100头以上，或幼虫300头以上，或淡色库蚊卵块50个以上，以居民区为主（依据：

自然情况下，昆虫抗药性的等位基因频率为10－6～10－8，抗性个体百分率为10－1。

）。

白纹伊蚊：

幼虫采集在150头以上，成蚊诱集在30头以上（伊蚊捕获成蚊的难度较大）。

中华按蚊：

在牲口棚内采集成蚊100头以上、或在稻田、积水等处采集300头以上幼虫。

抗药性监测，在采集试虫的当代或室内饲养的1～2代进行。

4.1.4监测药剂

拟除虫菊酯类溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯；有机磷类敌敌畏、毒死蜱、倍硫磷；氨基甲酸酯类残杀威。

根据当地用药情况进行药剂的选择。

（需要好好讨论）

4.1.5设施和器材

配备抗性监测实验室，有测试室或光照培养箱（可以调解温湿度和光周期），蚊虫饲养室，有通风橱、烘箱、防蚊驱避剂、防蚊罩等防护用品，诱蚊灯、吸蚊器、采集勺等蚊虫的采集器具。

有电子天平（感量为0.1毫克），200微升、1000微升移液器，200ml烧杯等。

有计算机、数据处理软件。

4.1.6监测方法

4.1.6.1幼虫浸渍法

以4龄初幼虫为测试对象，以丙酮将原药稀释，将待测药剂配置5～7个系列浓度，即在200ml的烧杯中加入99ml脱氯水和1ml相应的药液（最后一次稀释用水为溶剂），加入30头试虫，以200ml脱氯水为对照。

试虫在25℃、相对湿度为80±10％的条件下放置24小时，调查并记录各处理的死亡数。

死亡判断标准，用锐器触动不能逃逸的幼虫为死亡。

试验重复3次。

对照死亡率超过20％，试验无效。

4.1.6.2成蚊监测法

药纸的制备将白油和乙醚（AR）按1∶2比例混合作为溶剂。

杀虫剂按需要量溶解其中，配成一定浓度（附录4），吸取2.14毫升均匀滴于16厘米×12.5厘米的新华1号滤纸或其他质量相近的滤纸上。

2小时后待乙醚完全挥发即可应用。

药纸制备后应在6小时内使用，如需要可以把l0－20张药纸用大小相同的玻璃板夹紧，用橡皮膏把间缝封实，再装入黑纸袋中，在较低温下大约可以存放一个月，但一经开启即不能储存，必须在两三天内用完，如果已经装入接触筒，就只能用一次。

先把恢复筒接装在放隔板的一面，用吸蚊器吸取1～2只雌蚊吹入筒内，然后关闭隔板，在隔板另一面装上已衬贴药纸的接触筒，把隔板抽开，将恢复筒内蚊虫轻吹入接触筒，迅速关上隔板，将筒平放，即开始计算接触时间，完毕后再抽开隔板将蚊虫再吹入恢复筒，关上隔板，将筒直放，用浸有5％葡萄糖水的棉花团置于尼龙网上。

室温27±1℃，无论测定时间的长短，皆从接触完毕后24小时计算死亡率。

为了便于蚊虫在恢复筒内停留，可用白纸衬贴在筒内上端l／2或2／3，空出下端，以便于观察死亡掉下的蚊虫。

每剂量应至少测40只蚊，实验重复3次。

4.1.7统计与计算

用POLO软件或DPS软件进行数据统计，获得致死中浓度（LC50）值及其95％置信限，LC90及其95％置信限，毒力回归线的斜率b值。

4.2家蝇抗药性监测

4.2.1监测点的选择

监测点要考虑地理分布（经纬度、生境），每省选两个监测点进行。

监测点要相对固定。

4.2.2试虫采集

成蝇100头以上、幼虫300条以上，以居民区为主。

4.2.3监测药剂

拟除虫菊酯类溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯；

有机磷类敌敌畏、辛硫磷、毒死蜱；

氨基甲酸酯类残杀威。

4.2.3设施和器材

有抗性测试室或光照培养箱，有能够控制温湿度的家蝇饲养室。

电子天平（感量0.1毫克），200微升、1000微升移液器，0.05～0.1µL微量点滴器；500mL烧杯；饲养缸；养蝇笼。

在温度为25±1℃，相对湿度70～80%的条件下饲养，成蝇羽化后供给奶粉和白糖（比例为1:

1）。

4.2.4监测方法

用丙酮（分析纯）将原药配成5～7个系列浓度。

取3～5日龄，体重为18～20mg的家蝇成虫。

把含有乙醚（分析纯）的棉球将指形管口堵塞、轻度麻醉后，选健康雌虫，每处理30只置于平皿中，用点滴器（类型）将药液按浓度由低到高的顺序，点滴于中胸背板上，放入加有少量奶粉的500mL洁净的烧杯中，以5mL烧杯内放置海绵供水，在温度为25±1℃，相对湿度60%～70%的条件下饲养24h。

记录各处理的死亡虫数。

对照以丙酮处理，死亡率超过20％时需要重新进行。

试验重复3次。

死亡判断标准：

凡腹部上翻，六足抽搐，用探针触之不能翻身爬行者判为死亡。

4.2.5数据统计

用POLO软件或DPS软件进行数据统计，获得致死中浓度（LC50）值及其95％置信限，LC90及其95％置信限，毒力回归线的斜率b值。

试虫名称：

药剂名称：

测定人：

虫态：

；虫龄：

测定培育温度：

℃；湿度：

％

虫源地名：

英文药名：

处理日期：

年月日至月日

测定室温：

℃；湿度：

％

处理浓度

单位：

重复1

重复2

重复3

合计

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死/总

对照

/

/

/

/

/

/

/

/

处理虫数；毒力回归线：

；卡方X2：

斜率b值（95％置信限）：

LC50：

95％置信限：

LC95：

95％置信限：

备注：

附录1淡色库蚊对化学药剂的抗药性测定原始记录表

附录2白纹伊蚊对化学药剂的抗药性测定原始记录表

试虫名称：

药剂名称：

测定人：

虫态：

；虫龄：

测定培育温度：

℃；湿度：

％

虫源地名：

英文药名：

处理日期：

年月日至月日

测定室温：

℃；湿度：

％

处理浓度

单位：

重复1

重复2

重复3

合计

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死/总

对照

/

/

/

/

/

/

/

/

处理虫数；毒力回归线：

；卡方X2：

斜率b值（95％置信限）：

LC50：

95％置信限：

LC95：

95％置信限：

备注：

附录3中华按蚊对化学药剂的抗药性测定原始记录表

试虫名称：

药剂名称：

测定人：

虫态：

；虫龄：

测定培育温度：

℃；湿度：

％

虫源地名：

英文药名：

处理日期：

年月日至月日

测定室温：

℃；湿度：

％

处理浓度

单位：

重复1

重复2

重复3

合计

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死/总

对照

/

/

/

/

/

/

/

/

处理虫数；毒力回归线：

；卡方X2：

斜率b值（95％置信限）：

LC50：

95％置信限：

LC95：

95％置信限：

备注：

附录4家蝇对化学药剂的抗药性测定原始记录表

试虫名称：

药剂名称：

测定人：

虫态：

；虫龄：

测定培育温度：

℃；湿度：

％

虫源地名：

英文药名：

处理日期：

年月日至月日

测定室温：

℃；湿度：

％

处理浓度

单位：

重复1

重复2

重复3

合计

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死虫数

总虫数

死/总

对照

/

/

/

/

/

/

/

/

处理虫数；毒力回归线：

；卡方X2：

斜率b值（95％置信限）：

LC50：

95％置信限：

LC95：

95％置信限：

备注：

附录5中华按蚊测试基本情况记录

1.测定人，单位：

。

测定日期：

年月日。

2.试虫来源：

省（市、自治区）、区（县）、街道（村）、生境。

试虫名称（中文），（拉丁文）,性别,龄期,生理状态:

吸血□、未吸血□、半怀孕□、怀孕□。

测试杀虫剂：

药剂来源，有效期年月日，药剂的储存条件。

3.背景资料

杀虫剂使用:

处理蚊帐□；室内滞留喷洒□；使用灭幼剂□；农田用药□.

试虫的采集方式：

幼虫□，F1后代□，人诱法诱捕□，动物诱法诱捕□，室内捕获□，灯诱法□、其它□。

如果采集幼虫注明：

稻田□、雨水坑□、河边□、生活污水□、其它□。

附录6测试杀虫剂的推荐使用浓度

附录7推荐使用敏感基线

附录8成蚊测定用药纸的计算

WH0对纸上的剂量标准系以杀虫剂在白油中的浓度计算。

如混合液的l％实际为0.33％。

按照这种方法，每平方米滤纸滴混合液应为107.1毫升，乙醚全部挥发后仅残留白油35.7毫升，如含药量1％，即为0.357克。

滤纸的面积定为16×12.5=200平方厘米，为1平方米的1／50。

WH0多年来皆以杀虫剂在溶剂中的百分率为剂量标准，如溴氰菊酯的标准剂量为0.025％，实际每平方米药量0.0089克。

WH0专家委员会认为百分率与墙面药量无直接联系，建议今后使用“克／平方米’’的计量单位。

附录9关于化学杀虫剂对昆虫的毒力回归线统计问题

建议使用对大家所公认的统计软件，这样可以大大提高计算速度，减少出错的机会。

基本具有快速、简便、准确的特点。

常用的统计软件有POLO－PC，SAS，BA，DPS等多种。

1.使用国际通用的统计软件POLO－PC

LeOraSoftwarePOLO-PC,Berkeley,Calif

RusselR,RobertsonJL,SavinNE.POLO:

anewcomputerprogramforprobitanalysis.BullEntomolSocAm.1977;23:

202–213.

目前我们一直使用其它单位给的软件，其中有一些参数不能得到，我们正在连续一些国际有人，争取尽快由正规渠道购买正版软件。

例1

=F1

*deltamethrin

01303

0.026060

0.016051

0.00512090

0.011256060

0.00756059

0.0036042

0.0026018

0.00563019

0.003753014

0.00253011

0.0017304

0.001301

Indexofsignificanceforpotencyestimation:

g（.90）=.08179g（.95）=.12361g（.99）=.25008

EffectiveDoses

doselimits0.900.950.99

LD10deltamet.00122lower.00073.00061.00034

upper.00166.00175.00196

LD50deltamet.00309lower.00248.00232.00191

upper.00367.00382.00417

LD90deltamet.00782lower.00632.00607.00557

upper.01088.01213.01701

F1

deltametsubjects630controls130

log（L）=-282.4slope=3.178+-.250nat.resp.=.021+-.012

heterogeneity=4.01g=.124

LD10=.001limits:

.001to.002

LD50=.003limits:

.002to.004

LD90=.008limits:

.006to.012

2.使用具有我国知识产权的DPS数据处理系统

统计结果和POLO的结果相近，经过我们对试验数据核实没有显著差异，即计算的LC50及其95％置信限基本重叠。

例2

唐启义，冯明光著。

实用统计分析及其PDS数据处理系统。

科学出版社，2002。

附录10关于敏感基线的现状和设想

1建立敏感性基线的重要性

基线是衡量抗药性强弱的尺度，基线不统一就不能在全国范围内进行比较、分析。

根据现有文献，很难找到一个统一的标准。

以淡色库蚊对溴氰菊酯的使用的敏感基线为例：

程璟侠等使用淡色库蚊德敏感品系其LC50为0.24μg/mL（程璟侠等，1998）；本实验室长期保存的敏感品系LC50为0.987μg/mL，天津卫生防疫站使用的淡色库蚊德敏感品系其LC50为2.7μg/mL；中国科学院上海昆虫所淡色库蚊敏感品系的LC50值为0.1μg/mL。

南京医科大学朱昌亮实验室，引入中国科学院上海昆虫研究所后已在室内传70余代，检测对溴氰菊酯的半数致死浓度（LC50）为0.8μg/L。

问题：

1、溶剂对试验结果的影响。

2、温度、湿度、光周期对试验结果的影响。

3、试虫龄期不同。

敏感基线是相对的，如何建立一系列有代表性的敏感基线，将是我们急待解决的问题。

研究目的不同可以基线的表现不同。

如抗药性机制研究中使用的敏感基线，一般使用未选育的相同种群的毒力回归线为基线，再使用一个大家公认的敏感基线，尽量使其遗传背景一致。

为了进行质量控制，全国性的抗药性监测，敏感基线要有统一标准。

2昆虫产生敏感性差异的原因

抗药性的主要特点是分布上的区域性、抗性机制和及其遗传机制的多样性。

其主要原因有：

（1）抗药性遗传多样性丰富。

即使在没有接触任何药剂的情况下，也会对同种杀虫剂表现出约十倍抗药性差异。

（例1）。

（2）药剂使用历史和交互抗性的影响。

由于用药背景不同，各地蚊虫对淡色库蚊表现出不同的敏感性水平，如河北省冀州市对溴氰菊酯的敏感性资源保留较好，白淑萍等1999年发表的文章显示，其敏感性比实验室的敏感品系还要敏感，其LC50为0.02μg/mL。

药剂的使用背景可以影响一个种群对杀虫剂的抗药性水平。

如DDT与拟除虫菊酯类杀虫剂有交互抗性，二十实际80年代出的测定表明，在很多没有使用过拟除虫菊酯的地区也有抗药性发生。

（3）杀虫剂的作用机制多样，昆虫对药剂的敏感性程度由其行为习性、生理生化和遗传物质的不同所综合决定的。

即使是核酸水平的差异不大，还有细胞质水平的差异（例2）。

3如何建立敏感基线

理论上，敏感基线是没有使用某种杀虫剂，或未使用具有类似作用机制杀虫剂的前提下，采集靶标生物进行敏感性测定的结果。

除了对新开发的药物以外，尽量寻找受药剂污染少的区域，获得敏感品系。

在我国的不同区域，包括各实验室种群和野外种群，用统一的方法测定，获得敏感品系。

利用已经报道的相对敏感的毒力回归线为基线，但是到1998年以前WHO推荐使用区分计量法来测定抗性的强弱，由于该方法是单剂量处理试虫，试验结果不稳定，适用于抗性发生的早期。

随着拟除虫菊酯的大量广泛推广应用，浓度对数与死亡率几率值回归方程——毒力回归线法是国内外的首选方法。

例1：

GeographicVariationinSusceptibilityofChilosuppressalis（Lepidoptera:

Pyralidae）toBacillusthuringiensisToxinsinChina

FengxiaMeng1,2,KongmingWu1,3,XiwuGao2,