植物组织培养实验教案.docx
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植物组织培养实验教案
实习二营养培养基配制
一、培养基母液配制
为了减少工作量，减少多次称量所造成的误差，一般将常用药品配成比所需浓度高10—100倍的母液，现以MS培养基为例，预先配制，四组不同母液，说明母液的配制方法。
MS培养基母液配制（单位：
毫克 mg）注意：
1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2．微量元素母液按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物分别置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，混合定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。
3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中加热，不断搅拌，溶解后两液混合，调PH5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。
4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
6.制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。
7.称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。
母液
成 分
规定量
浓缩
倍数
称取量
母液
体积
配制1升培养基吸取量定容
编号
种类
大量元素
KNO3
1900
10
19000
1000
100
NH4NO3
1650
10
16500
MgSO4·7H2O
370
10
3700
KH2PO4
170
10
1700
CaCl2·2H2O
440
10
4400
微量元素
MnSO4·4H2O
22.3
100
2230
100
10
ZnSO4·7H2O
8.6
100
860
H3BO3
6.2
100
620
KI
0.83
100
83
Na2MoO4·7H2O
0.25
100
25
CuSO4.5H2O4
0.025
100
2.5
CoCL2.6H2O
0.025
100
2.5
铁盐
Na2-EDTA
37.3
100
3730
1000
10
FeSO4.4H2O
27.8
100
2780
有机物
甘氨酸
2.0
50
100
500
10
盐酸吡哆醇
0.5
50
25
盐酸硫铵素
0.1
50
5
烟酸
0.5
50
25
肌酸
100
50
5000
二、养培养基配制程序
（一）母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1：
母液吸取量=母液体积×——————————
母液浓缩倍数
培养基要求的含量
公式2：
母液吸取量=———————————（各种生长调节剂）
母液每CC的含量
（二）各种母液按顺序编号排列
A.大量元素；B.CaCl2.2H2O；C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：
配制0.5mg/ml的NAA称取50mg，NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G.细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT用少量1NHCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
（三） 配制培养基
1.称取5-7g琼脂，30g蔗糖加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.
2.各种母液的吸取
用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml
分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml
用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml
用2ml移液管吸取生长素NAA1.5ml；用0.5ml移液管吸取KT0.5ml
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，定容至1000ml，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1NNaoH和1NHCL调整。
二、分装：
用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装70支试管，即每支试管15ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：
培养基勿碰试管壁。
三、包装：
分装好的试管用棉塞塞上，包上包装纸，每5~7支试管捆成一扎，标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤：
各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。
附：
几种常用药剂的配制
（一）用95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。
学习配制70%和75%酒精。
（二）消毒剂
1.20%次氯酸钠溶液 称取20g次氯酸钠用少许水溶解，100ml水定容。
2.0.1%升汞（HgCl2）溶液 称取0.1gHgCl2少许水溶解，100ml水定容。
（三）1摩尔浓度（mg/L）NaOH和1摩尔浓度（mg/L）HCl配制。
摩尔浓度是指用1升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。
用M表示。
1.NaOH摩尔浓度（M）
NaOH摩尔质量=分子克数=40g
1MNaOH是指1000ml溶液中含有40克摩尔质量的NaOH，现要配制100ml
40×0.1＝4g
称取NaOH4g，用少量溶解，定容100ml.
2.HCl的摩尔浓度
具体配制酸的mol浓度时，应考虑原浓酸的比重mol浓度。
要求配制的mol浓度×需配制的体积×原酸分子量
V＝———————————————————————
原酸的百分浓度×原酸的比重×1000
配制1.0M HCl 100ml，量取38%，比重为1.19的HCl8.06ml加蒸馏水，定容至100ml。
生长调节剂母液配制
为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。
激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。
实验三 洗涤――灭菌
植物组织培养能否成功重要的一环是在无菌条件下进行操作与培养，导致污染的来源主要有：
⑴ 器皿和用具；⑵ 培养基；⑶ 培养材料；⑷ 工作人员本身；⑸ 操作时的空气。
防止污染的有效方法是将所有与培养有关的器皿，用具、培养基、接种室、培养室等进行灭菌和无菌操作。
一、洗涤
（一）玻璃器皿的洗涤
1.新购置的玻璃器皿的洗涤（学习、操作）因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，干后备用。
2.已用过玻璃器皿先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。
3.对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：
吸管，滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲净晾干，再浸入硫酸－重铬酸钾洗液中浸泡，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－3遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。
4.对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。
带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半小时，刷洗后，自来水冲干净。
若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入60－70℃温箱中1加热－2小时，待石蜡融化后，再用废纸反复擦2－3次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物，先用70%酒精棉球擦数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲洗，晾干，再泡入洗液。
（二）金属器皿新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4 ）布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。
二、灭菌
（一）器皿和用具常用灭菌方法：
1.热压灭菌法（学习操作）
将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1压力下灭菌20－30分钟。
2.干热灭菌法
洗净玻璃器皿置于电热干燥箱中，150℃40分钟或120℃两小时，待冷却后使用。
（二）无菌室灭菌（接种室、培养室）
1用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。
2薰蒸（学习操作）用甲醛、高锰酸钾提前1－3天薰蒸密封房间
方法1：
甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。
方法2：
甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以10：
1比例混合。
3接种前用70－75%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。
4用紫外光灯进行照射灭菌接种箱及用具30－40分钟。
三、灭菌：
固体营养培养基灭菌通常都用热压法，液体培养基可用热法，也可用过滤法，现操作热压法灭菌。
热压灭菌的锅具有温度范围115~135℃，良好的灭菌取决于时间、压力、温度和被灭菌的容积，此法优点是：
迅速、简便、全部微生物和病毒均能被破坏并无吸附现象。
缺点：
（1）会引起PH改变：
降低0.3~0.5个单位值；
（2）某些化合物会分解或发生化学反应，在太高温度下热压处理会使糖焦化。
这种产物可能有毒；（3）热压灭菌时间太长会使盐沉淀下来；（4）会使琼脂解聚；（5）导致某些有机的生理活性物质的活力下降。
因此，为达到良好的灭菌效果，而又尽量减少对营养成分的不利影响要求。
（1）盛有20~50ml营养培养基的容器就在121℃中保持20分钟；
（2）盛有50~500ml营养培养基的容器就在121℃中保持25分钟；
（3）盛有500~5000ml营养培养基的容器就在121℃中保持35分钟；
具体操作步骤：
1.高压锅放水至平把架；
2.把包扎好的培养基装入高压锅;
3.盖上热压锅盖,上紧螺帽（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀.
4.把热压锅放在3000W电炉座上,然后接通电源.
5.压力计升至0.5Kg时，打开放气阀,排除冷空气（此步很重要）反复两次至完全把冷空气排除。
6.排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg压力（121℃）下灭菌20~25分钟即可，但要注意保持稳定压力。
7.灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀（注意要逐渐放气）待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍冷后再把培养基取出。
8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.5Kg时排锅内冷空气，重复两次,直至冷空气排除，关上放气阀→1Kg压力（121℃）下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
实验四、五外植体的分离、灭菌、 接种和培养实习（初代培养）
植物组织培养的成功首先在于初代培养，即能否建全起于无菌外植体，注意几个重要环节。
保证无菌主要保证培养材料和培养基的无菌状态
培养室的良好的清洁环境，以及工作人员的无菌操作技术，材料灭菌，不同作物，一株不同部位都有不同的要求，常用的消毒剂有漂白粉（1%-10%的溶液），次氯酸钠液（1-3%），升汞（HgCl0.1-1%）酒精70%，双氧水（3-10%）等。
材料灭菌的方法视不同作物，不同部位而异。
（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒，因暴露于空气中，有较多茸毛、油脂、蜡质和刺等，首先用自来水长时间冲洗，特别多年生木本材料更注意，有的可用肥皂、洗衣粉或吐温进行洗涤→酒精浸泡数秒钟→无菌水冲洗2-3次→按材料老、嫩用枝条的坚实程度，分别用2%-10%次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟→无菌水冲洗3次→接种。
（2）果实及种子消毒，果实：
自来水冲洗10-20分钟→纯酒精迅速漂洗一下→2%次氯酸钠溶液浸泡10分钟→无菌水冲洗2-3次→取出果内种子或组织进行培养。
种子：
自来水冲洗10-20分钟→10%次氯酸钙浸泡20-30分钟甚至几个小时，依种皮硬而定，对难于消毒的还可用0.1%升汞或1%-2%溴水消毒5分钟，进行胚或胚乳培养，对种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮再用4-8%次氯酸钠溶液浸泡8-10分钟→无菌水冲洗后→接种。
（3）花药消毒用于培养的花药，实际上多未成熟，外有花萼，花瓣或颖片保护，处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可，一般用70%酒精浸泡数秒钟→无菌水冲洗2-3次→漂白粉清液浸泡10分钟→无菌水冲洗2-3次→接种。
（4）根及地下部分器官的消毒，这类材料生长于土中，消毒较为困难，先用自来水洗涤，用软毛刷刷洗→用刀切去损伤及污染严重部位→吸干后→纯酒精漂洗→0.1%-0.2%升汞浸泡5-10分钟或2%次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟→无菌水冲洗3-4次→无菌滤纸吸干后→接种。
若上述方法仍不见效时,可将材料浸入消毒液中进行抽气减压帮助消毒液的渗入达到彻底灭菌的目的。
条件合适
要成功地建立初代培养，首先一定要选择好合适的作物种类，品种及培养部位，目前组织培养已经获得成功的植物，几乎包括植物的各个部位，在生产实际中，必须选取最易表达全能性的部位，增加成功机会，降低生产成本，大多数植物茎尖是较好的部位，由于其形态已基本建成，成长迅速、遗传性稳定，也是获得无病毒的主要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了广泛的应用，而叶片的培养利用更为普遍，材料来源最为丰富，一些培养较困难的植物则往往可以通过子叶，下胚轴培养奏效。
花药和花粉培养成为育种和得到无病毒苗的主要途径之一，其他可根据需要采用根，花瓣鳞茎等部位培养，总之，在确定取材部位时，一方面要考虑培养材料的来源有保证、容易成苗，另一方面要考虑到特别是通过脱分化产生愈伤组织培养途径是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状，取材亦受季节影响，器官的生理状态和生育年龄，材料大小的影响，茎尖培养存活临界大小应为一个茎尖分生组织带有1-2叶原其，大小为0.2-0.3mm,叶片、花瓣等约为5mm2,茎段则长约0.5mm，甘蔗心叶愈伤组织中，5mm左右；第二，选择好合适的培养基激素及其他添加物；第三，注意掌握适宜的培养条件，如光照、温度、湿度。
1．光
光因素包括日照长度，辐射强度，光源（波长）
（1）光照长度（光周期）——对此问题了解得很少，常用的日长即选用14-16小时，虽然也有连续光照的，不同培养物对日长要求有时很严格，如需暗萌发的种子要求在连续黑暗中才能萌发，需光萌发种子必须有光照。
有的植物进行休眠或开花，必须选择特定的日长范围。
（2）辐射强度——培养瓶内的培养物不能采用像田间或人工气候室那么强的光照（30-70Wm－2）通常用8-15Wm的光照。
（3）光源（波长）——红光能促进生长和分化
2．温度
培养室内常用温度24-26℃，25±2℃一般低于15℃培养的组织生长出现停滞，高于35℃的生长也不利，促进芽的温度略低于增殖苗的温度一般恒温。
3．湿度：
培养容器内的相对湿度几乎达到100%，而环境中的温度会影响培养基湿度一般要求70%-80%的相对湿度。
4．气体的影响：
试管苗生长和繁殖需氧气，液体培养需进行振荡或浅层培养以解决供氧问题。
无菌操作：
1.在准备室内改穿经过灭菌的白色工作服及拖鞋，戴上白布帽和口罩，才能进入无菌室。
2.进入无菌室前工作人员双手须用肥皂洗净，进行操作前用75%C2H5OH擦抹双手。
3.操作时，注意：
（1）若是试管，应在酒精灯火焰上封口，接种迅速避免烧伤材料，若是培养瓶，拧开盖子，迅速将材料放入。
（2）每接一瓶，用具都应用95%酒精棉球擦并在火焰上烧灼，避免交叉污染。
（3）操作结束，整理，清洁干净用具。
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