生物工程下游技术.docx

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生物工程下游技术

1.请描述生物工程下游技术的一般工艺流程，并分析各步可采用方法及其原理

按生产过程分，下游技术工艺过程大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（纯化）、成品制作。

发酵液→预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作

加热过滤匀浆法离心沉淀（重）结晶浓缩

调PH离心研磨法双水相吸附离子交换干燥

絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌加工

超滤膜分离成型

结晶

（1）预处理和固液分离

加热法：

加热可降低液体黏度，只适用于产物对热较稳定的发酵液。

在适当的温度和受热时间下可使菌体或蛋白质凝聚形成较大颗粒的凝聚物，改善发酵液固液分离特性。

加热是蛋白质变性凝固的有效方法。

调节PH法：

PH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节PH可以改变菌体和蛋白质的带电性质，从而改变其过滤特性。

蛋白质属于两性电解质，两性电解质在溶液中的PH处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加溶解度最小。

因此，调节溶液的PH，可使蛋白质溶解度下降而析出，这是除去蛋白质的有效方法。

改变PH，还能使蛋白质变性凝固。

絮凝：

在某些高分子絮凝剂的存在下。

基于桥架的作用，使胶粒形成絮凝团的过程。

（2）提取（初步分离）

沉淀：

在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。

原理：

沉淀分离就是通过沉淀，在固-液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。

吸附：

吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。

吸附的原理：

固体部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。

向的一面受部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。

萃取：

利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。

原理：

利用各物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理来达到将目标产物分离纯化的目的。

超滤：

超滤是利用膜的透过性能，在静压差的推动力作用下，达到分离离子、分子及其某种微粒目的的膜分离技术。

原理：

超滤是一种筛分过程，在一定的压力作用下，含有大小分子溶质的溶液流过超滤膜表面时，溶剂和小分子物质（如无机盐类）透过膜，作为透过液被收集起来；而大分子溶质（如有机胶体）则被膜截留而作为浓缩液被回收。

结晶：

将形成晶型物质的过程称为“结晶”。

原理：

通过结晶溶液中的大部分杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤即可得到纯度高的晶体。

（3）精制（纯化）

（重）结晶：

重结晶原理是利用混合物各组分在某种溶剂中溶解度不同或在同一溶剂中不同温度时的溶解度不同而使它们分离。

离子交换：

离子交换技术是以圆球形树脂（离子交换树脂）过滤原水,水中的离子会与固定在树脂上的离子交换。

常见的两种离子交换方法分别是硬水软化和去离子法。

硬水软化主要是用在反渗透（RO）处理之前,先将水质硬度降低的一种前处理程序。

软化机里面的球状树脂,以两个钠离子交换一个钙离子或镁离子的方式来软化水质。

色谱分离：

 色谱分离过程是被分离的样品（混合物），在两相间进行分配，其中一相固定不动的，称为固定相。

另一相是流动的，称为流动相或移动相。

混合物借助流动相的推动，顺流动相的流向而迁移。

混合物各组分迁移的速度取决于各组分在固定相和流动相之间的分配系数（对气-液分配色谱）或吸附能（气-固吸附色谱）。

分配系数大的或吸附能大的组分停留在固定相中时间长，从色谱柱中流出的时间晚。

分配系数或吸附能小的组分在固定相中停留时间短，先从柱中流出。

从而使混合物中各个组分得以分离。

膜分离：

膜是具有选择性分离功能的材料，利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离。

它与传统过滤的不同在于，膜可以在分子围进行分离，并且这过程是一种物理过程，不需发生相的变化和添加助剂。

（4）成品制作

浓缩：

指使溶剂蒸发而提高溶液的浓度，泛指不需要的部分减少而需要部分的相对含量增高。

原理：

浓缩从溶液中除去部分溶剂（通常是水）的操作过程，也是溶质和溶剂均匀混合液的部分分离过程。

通过浓缩可除去食品量的水分，减少质量和体积，降低食品包装、贮存和运输费用；浓缩可以提高制品浓度，增大渗透压，降低水分活度，抑制微生物生长，延长保质期；浓缩可作为干燥、结晶或完全脱水的预处理过程；通过浓缩可以降低食品脱水过程中的能耗，降低生产成本；浓缩还可以有效除去不理想的挥发性物质和不良风味，改善产品质量。

干燥：

在干燥过程中，水分从物料部移向（扩散）表面，再由表面扩散到热空气中。

干燥过程得以进行的必要条件：

是被干燥物料中的水分所产生的水蒸气分压大于热空气中水蒸气分压。

若二者相等，表示蒸发达到平衡，干燥停止；若热空气中水蒸气分压大，物料反而吸水。

所以为了使物料干燥，必须控制热空气的相对湿度RH（饱和空气RH=100﹪，未饱和空气RH﹤100﹪，绝干空气RH=0﹪）

2.请分析表面活性物质在生物工程下游中可以有哪些应用

反胶团萃取：

正向胶团（normalmicelle）是表面活性剂分子在极性溶剂,如水中形成的一种亲水基团（头）朝外,而疏水基团（尾）朝的具有非极性核的多分子聚集体。

洗涤剂中的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团,其非极性核可以溶解各种油污。

从而达到去污的效果。

与此相反,表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会形成亲水头向和疏水尾向外的具有极性核（polarcore）的多分子聚集体（aggregates）,由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反,因此,称为反胶团,反胶团的极性核可以溶解某些极性物质,而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质,即所谓二次加溶原理。

例如,反胶团的极性核在溶解了水后,在核形成了“水池”（waterpool）,可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等生物活性物质。

由于胶团的屏蔽作用,使这些生物物质不与有机溶剂直接接触,而水池的微环境又保护了生物物质的活性,达到了溶解和分离生物物质的目的。

这种技术既利用了溶剂萃取的优点,又实现了生物物质的有效分离,成为一种新型的生物分离技术。

（1）三种蛋白质的相互分离：

利用反胶团的方法萃取分离蛋白质的研究中,首先采用AOT/异辛烷反胶团体系,通过调节水相的pH和离子强度,分别将α-核糖核酸酶、细胞色素C和溶菌酶从三者的混合液中分离开来。

它们的相对分子质量相近,但等电点有一定的差别。

作者利用pH值和离子强度对反胶团萃取这三种蛋白质的影响的差别建立了这三种蛋白质分离的流程。

当pH>某个蛋白质的pI时,蛋白质带负电荷,相反时蛋白质带正电荷。

首先在pH=9和较低的离子强度下,α-核糖核酸酶带负电荷不被反胶团萃取,留在水相中,但细胞色素C和溶菌酶都带正电荷,可萃入有反胶团的有机相中;第二步,利用提高离子强度,可将细胞色素C从反胶团反萃到水相中;;最后,再提高pH值和离子强度,可将溶菌酶也反萃到水相中。

这样就成功地分离了这三种蛋白质。

日本学者利用此体系萃取分离了牛血清蛋白、α-胰蛋白酶和细胞色素C。

还利用此体系成功地分离了溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。

（2）从复杂混合体系中分离蛋白质

在实际应用中往往遇到的是复杂的混合体系,例如:

其中既含多种蛋白质,又含有发酵底物、细胞碎片、细胞组织或血液成分,从中分离某种蛋白质是很困难的。

不少研究者对此进行了尝试,取得了一定的进展。

例如,用AOT/异辛烷体系,Aries-Barros从细菌发酵液中提取了2种脂肪酶;Leser从大豆和向日葵中分离了蛋白质、油脂和多酚。

Giovenco利用表面活性剂可以破坏细胞壁的特点,用反胶团体系直接提取了胞酶。

（3）反胶团萃取的过程开发

Dekker利用混合-澄清槽萃取器将反胶团萃取和反萃取结合在一起,使反胶团溶液在两个单元间循环,实现了过程的连续化操作。

如图7所示。

其反胶团体系为:

TOMAC/异辛烷+非离子型表面活性剂RewopalHV5,控制值和离子强度,萃取和反萃取α-淀粉酶,可使酶的浓度提高17倍,收率达85%,每个循环表面活性剂的损失<2.5%。

3.电泳和层析都是产品高度纯化的方法，请分析他们在进行生物产品分离时的适用性和异同

（1）适用性：

色谱和电泳是目前所知最好的两种物质分离方法。

（2）不同点：

①电泳：

电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量（%）的方法。

电泳具有灵敏度高、重复性好、测定围宽、适应性强、操作容易、结果直观、设备简单、兼备分析、鉴定、分离功能等特点。

②层析法：

层析法是利用混合物中各组成部分物理化学性质的差异（如吸附力,分子形状及大小,分子亲和力,分配系数等）,使各组成部分在两相（一相为固定的,称为固定相;另一相流过固定相,称为流动相）中的分布程度不同,从而使各组成部分以不同的速度移动而达到分离的目的。

但是电泳目前不能用于生产规模的生物大分子的分离和纯化，所以人们把分离和纯化生物大分子（包括蛋白质、酶、核酸和多糖等，简称蛋白）的研究重点一般都放在色谱上。

（3）相同点：

都是高效分离技术，操作均可自动化，且有多种不同的分离模式。

4.请设计一种你认为生物工程下游纯化虾青素的纯化流程，（绘制流程图，说明原理及操作步骤）

原料预处理→总类胡萝卜素提取→虾青素酯的皂化→虾青素的纯化

（1）提取。

用溶剂萃取法从新鲜海虾虾壳中提取虾青素。

溶剂萃取法原理：

溶剂萃取是基于有机溶剂对不同的金属离子具有不同的溶解因而对溶液中的金属离子可以进行富集与分离。

操作步骤：

将一定量新鲜虾壳放入塑料桶中,不断搅拌下,加入5%的稀盐酸,至不冒气泡（PH=5.0-70）,虾壳再浸泡,水洗至中性。

将虾壳敲碎,尽量去除水分。

将经预处理的新鲜虾壳放入广口瓶中,加入丙酮,丙酮用量为浸没虾壳的量的1.5倍,室温,暗处、密封浸泡24小时。

过滤。

虾壳继续用新丙酮浸泡,滤液先加石油醚,再加水萃取。

石油醚层在低于40℃下真空浓缩得粗色素油,水层蒸馏回收丙酮。

提取过程重复三次,虾壳几乎无颜色,滤液颜色为微黄色,滤饼结束浸泡。

粗色素油中虾青素含量用高效液相色谱分析,粗色素油用二氯甲烷一甲醇配制。

（2）皂化。

强碱条件下皂化虾青素。

原理：

藻类和天然植物中的虾青素主要以虾青素单酯和双酯的形式存在，酯化形式的虾青素生物利用度较低，且虾青素酯组分复杂，纯化和检测都较困难，因此需要将提取的虾青素酯皂化水解成游离虾青素来提高虾青素的纯度和生物利用度。

虾青素含有长链不饱和的双键体系，而环上有烯酮醇，所以很不稳定，容易异构化和降解，特别是在碱性条件下极易被氧化成半虾红素和虾红素。

因此，在皂化的时候一定要严格控制条件以降低对虾青素的破坏。

操作步骤：

采用0.02MKOH的乙醇或甲醇溶液在低温或室温下对虾青素酯进行皂化。

（3）纯化。

用层析法纯化虾青素粗品。

原理：

经过皂化得到的虾青素含量较低，还含有其他类胡萝卜素、脂肪类等其他物质，通过层析进行纯化来得到高纯度的虾青素制品。

操作步骤：

以硅胶为固定相，极性与非极性混合溶剂作流动相，随着样品溶液通过硅胶柱,硅胶柱明显出现黄色带和红色带,流出液颜色开始为淡黄色,当红色带到达柱底部时,流出液颜色变为红色。

进样结束,正己烷洗脱,流出液颜色从红色变为淡黄色。

但根据TLC分析,流出液中无虾青素和游离虾青素,这从表4.1可以看出。

以硅胶为固定相的柱层析分离虾青素实验条件:

硅胶399,硅胶层高度33.5cm;29虾青素粗品溶于40ml正己烷中;进样速度.05ml/min;洗脱速度:

1ml/mln;室温9℃。

5.请提出一种你认为生物工程下游纯化流程中需要改进的方法，并提出你的改进方案，进行可行性分析

生物工程下游技术中每个纯化过程都不是单一存在的，可以采用两种或三种方法结合的方式进行纯化，可以达到更高的纯化效率，也可以达到大规模批量生产的目的。

例如一般采用色谱的方法进行纯化，提取的物质纯度高，但不适用于大批量生产。

改进方案：

将吸附树脂和硅胶结合进行分离和纯化。

目前常用的吸附树脂是大孔网络吸附树脂。

大孔吸附树脂是一种大孔结构的高分子吸附剂，具有吸附性和分子筛性能。

由于其具有吸附容量大、吸附速度快、易解吸、易再生、对有机物选择性好等优点，现以广泛应用于中药等领域。

不足之处是易带入有机残留物，需进行预处理后使用，并对产品的有机残留物进行检测。

硅胶柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

例如在对环孢菌素A的分离纯化中根据环孢菌素A弱极性的特征,引入非极性大孔吸附树脂层析技术,并结合硅胶柱层析建立了环孢菌素A分离纯化的工业化路线。

大孔吸附树脂层析选用D101树脂作为吸附介质,提取液丙酮含量控制在50%,最大吸附量为35mg/g湿树脂,洗脱剂选用丙酮;硅胶柱层析选用42~64μm硅胶作为层析介质,最优层析条件为柱床高径比10∶1,流动相配比V（石油醚）∶V（丙酮）=70∶30,流速80mL/min,环孢菌素A上样质量浓度100g/L,硅胶层析平均收率为84.2%,环孢菌素A纯度可达到97%以上,整个工艺总收率为65%~70%。

后续的实验也可以参照此方法，将吸附树脂和硅胶相结合进行分离纯化，能弥补两种技术存在的缺陷，达到更高的纯化效率，同时可以进行大规模批量生产。