花粉和花药培养.pptx

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植物组织培养学,课程基本情况,32学时主讲教师:

霍秀文、刘艳联系方式:

主要参考书,王蒂植物组织培养中国农业出版社，2004潘瑞炽植物组织培养广东高等教育出版社，2001周维燕植物细胞工程原理与技术中国农业大学出版社，2001,第五章花药和花粉培养,一、概况,1.概念花药（花粉）培养指应用植物组织培养技术，把发育到一定时期的花药（花粉）接种到人工培养基上，改变花粉的发育途径，形成花粉胚或愈伤组织，最终发育成花粉植株（单倍体）的技术,花的结构,异同点,区别花药培养属于器官培养范畴，花粉培养属于细胞培养范畴,共同点在培养过程中都是花粉发育，均可获得单倍体细胞系或单倍体植株,2.发展概况,1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚状体直接起源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本、法国、丹麦、德国等相继开展花培研究工作，目前已有10个科，24个属、34个种、250多种高等植物的花药培养获得成功由于花药各部分组织的干扰，培养产物往往为不同倍性的体细胞的混合体,花粉培养始于50年代，Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织，随后人们进行了很多研究，在许多植物上进行花粉培养，同时随着培养技术的逐步完善（看护培养、条件培养），获得愈伤组织、胚状体、有的还获得单倍体植株,我国花培发展概况,始于70年代，将花培与传统育种手段相结合，先后培育出一大批具有研究和应用价值的品种。

如烟草、小麦、玉米、甜椒等花培新品系、品种,1974年，中科院植物所与山东烟草研究所合作，成功育成烟草新品种，并大面积推广，这是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种,我国花培发展概况,国际公认，我国的花培工作处于国际领先水平。

我国有30多种植物进行花培试验，20多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首创，同时在花培方法，机理等方面作了深入研究德著名学者Melchers：

“花药培养起始于印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培养的单倍体育种的应用而言，中国在世界上处于领先地位”,3.意义,a.基础理论研究方面,研究减数分裂，花粉生长机制的重要方法用来进行生理、生化、遗传等基础理论的研究,花粉粒体积小，数量多，形状、内含物成份基本一致，是比较均一的起始材料，便于在人工控制条件下研究它们的生长、分化、遗传等变化过程,3.意义,b.遗传育种=单倍体育种中的意义,可获得纯合二倍体，大大缩短育种周期用于远缘杂交育种，克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选，大大提高突变育种的工作效率,二、培养方法,1.途径,愈伤组织再分化形成植株,通过胚状体形成植株,脱分化到再分化，变异率提高，混倍现象明显取决于培养基中激素的种类、浓度配比,程序简单，不需再分化，一次成苗,技术还没有完全掌握,花粉植株,杂合二倍体植株,花药培养,花药,花粉,花粉培养,花粉愈伤组织,单倍体苗,花粉胚原,愈伤分化花粉胚,单倍体植株,纯合二倍体植株,单倍体胚,胚发育,成苗,花粉细胞分裂增殖,单倍体愈伤组织,愈伤分化,单倍体苗,2.花培形成单倍体的方式图解花蕾花药,花药培养与花粉植株的形态发生方式,花苞,间接雄核发育,愈伤发生,花药,直接雄核发育,单倍体愈伤,原胚,胚,小植株,再生,单倍体小植株,花药培养,雄核发育,胚状体发生途径,愈伤组织发生途径,3.花粉培养,优点不存在体细胞干扰，没有混倍现象小孢子能均匀地接触化学物物理诱变因素，是研究吸收、转化和诱变的理想材料小孢子培养可观察到雄核发育的全过程，是很好的遗传和发育研究的材料体系缺点培养技术难度大,

（1）花粉分离,自然散落法,固体培养基,液体培养基,裂开，花粉散落,移走花药花粉培养,花粉散落,过滤离心浓缩,接种培养,未开消毒花的花灭菌药,适用于少量花粉培养,机械挤压法,花粉+碎片混合物,花粉沉淀,离心,104-105个/ml,培养,无菌液培养基花药玻棒挤压,200目镍网过筛,花粉200转/分弃上清，滤液,离心,200转/分,液体培养基,液培养基收集纯净花粉,机械挤压法,优点操作简便适于双子叶植株，不适于禾谷类，易损伤花粉粒,缺点,花粉中易混有体细胞悬浮液中花粉密度不易控制,注意：

液体培养基中加蔗糖或甘露醇，调节渗透压，避免花粉吸水胀裂,平板培养,

（2）花粉培养方法,花粉浓缩液,含有2倍培养密度的花粉悬浮液,固培40熔化,等体积,含有单倍培养密度的花粉培养液,薄层用蜡封,细胞团,平板培养,花粉平板培养示意图,平板培养（续）,植板率=,100%,Nitsch等（1973）先后将曼陀罗和烟草花粉放在平板上培养，形成了胚，进而分化成单倍体小植株优点：

便于对单个细胞标记观察,每个平板上形成的细胞团数目每个平板上接种的细胞数目,看护培养,花药固体培养基花粉粒润湿的滤纸细胞团,Sharp等（1972）培养番茄花粉，形成了细胞无性系,微室悬滴培养法,花药消毒,花药裂开花粉散落,悬浮液50-80粒/滴,盖玻片,置于凹穴载玻片上,石蜡封片,细胞团,静置一夜,收集悬浮,1滴,翻转,25转动,示意图,凹穴载玻片,盖玻片,悬滴,石蜡,Kamega等用此法用甘蓝芥蓝的F1代成熟花粉培养获得成功优点便于观察缺点无法添加培养液,条件培养,在合成的培养基中加入失活的花药提取物，接入花粉进行培养失活花药的提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功目前，此法用的较多,花药+培养基,取出花药，沸水，杀死细胞,研碎,离心,上清液无菌过滤,添加入培养基,培养,花粉植株,1周花粉萌动,4.花药培养,

（1）培养方法,琼脂固体培养法培养基中加入0.5-0.7%琼脂，呈半固体状态，花药1/3浸入培养基中而不沉没为宜,液体培养法,注意事项,通气状况,直接将花药接入呈液体状态的培养基中少量加液体培养基成一薄层，,使花药浮于液面，与空气接触,加入聚蔗糖，增加比重，使花药不下沉浮于液面上,及时转移沉入底部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养效果,

（2）操作步骤,取材（注意时期）,预处理（高温、低温、N饥饿等）,消毒,无菌接种避免损伤,愈伤1-3mm,胚状体,分化培养基,单倍体植株,三、影响花培成功的因素,花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难有些难培养植物诱导频率很低，有些植物（裸子植物）至今没有获得真正的花培植株,诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响,

（一）供试材料,1.材料的基因型材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功禾本科水稻优于小麦亚种水稻粳亚种（40-80%）优于籼米亚种（2%）花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性,2.植株的生理状态和年龄,年幼植株花培成功率高开花始期成功率高,烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天，诱导率最高,与植株的营养和生长条件有关N饥饿高N水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高,3.花粉发育时期,四分体时期单核期-早、中、晚期双核期三核期,是影响花培成败的最关键因素之一,被子植物的花粉发育阶段,高等植物雌雄配子形成过程,不同植物最适诱导期不同,曼陀罗、烟草属、水稻-单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好小麦、玉米-只有单核中期才能诱导大麦-单核晚期最佳,一般采用单核中-晚期的花粉培养,的合适,处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗,？

小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成在小孢子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合，或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率,培养前应确定花粉发育时期,镜检：

醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矾法（木本、番茄）利用相应的形态学指标,对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期,4.材料的预处理,低温预处理,烟草：

7-9，7-14天番茄：

6-8，8-12天水稻：

10，2-14天小麦、黑麦：

1-3，2-20天,常温下N饥饿预处理乙烯、高糖、离心预处理,试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率,

（二）培养基,1.基本培养基MS应用最多，N6、B5、Nitsch也有应用不同植物种类，适用的培养基不同双子叶：

Nitsch、MS十字花科、豆科：

B5水稻等禾谷类：

N6,2.碳源,蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用,不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜烟草：

2%诱导胚状体小麦：

8-10%愈伤；5-8%分化水稻：

4-6%愈伤；2-3%分化玉米：

12-15%愈伤,3.激素,花粉,愈伤组织,植株,胚状体,植株,脱分化,再分化,关键决定于激素种类、浓度、配比,实例,小麦：

2mg/L2.4-D愈伤；2mg/L胚状体,茄科,高生长素,花粉胚,愈伤组织,愈伤组织,低生长素,高生长素,植株,低生长素高细胞分裂素,4.其它添加物,有机附加物水解乳蛋白水解酪蛋白酵母提取物肌醇谷氨酰胺等,活性炭（0.5-1%）,吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛吸附了激素，降低了激素水平,（三）培养方法和培养条件,1.材料的接种保证完全无菌条件注意接种密度104-105粒/ml为好，花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导密度太高，养分消耗太快密度太低，诱导率下降,2.培养方法,液体培养基近年来较多采用优点:

诱导率显著提高缺点:

有些植物进一步分化困难，白化苗率提高利用条件培养基也可大大提高培养效率,3.培养条件,温度：

最重要，通常24-28最适光照：

影响分化途径,愈伤组织,植株,暗,光,花粉光胚状体,从花药囊中长出，茎叶细弱，根系不发达，很难直接移栽，需锻炼壮苗,（四）植株的诱导和移栽,花粉胚-植株愈伤组织-植株,愈伤组织的年龄显著影响分化频率,实例,小麦水稻,愈伤组织2-3mm,分化率50-80%,分化率8-10%,5-8天,20天,转移分化培养基,结论,愈伤组织及时转移是诱导分化的关键。

太早不利于愈伤成活和生长；太晚分化率下降,通常，愈伤1mm即可转移,（五）花粉植株的倍性和加倍,花粉植株中含有大量的非单倍体单倍体35.3%,二倍体53.4%多倍体+非整倍体5.2%混倍体6.1%,2496株水稻花粉植株,非单倍体出现频率与植株种类、花粉发育时期、激素种类和浓度、花粉植株的发生方式、继代培养时间等有关,倍性,加倍大部分单倍体需经人工加倍，通常秋水仙素，0.02-0.4%,草莓花药愈伤组织,草莓花药再生组织,草莓花药再生植株,植物组织培养中体细胞胚的形成,