基因工程实验操作技术.docx
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基因工程实验操作技术
总RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3.在上述EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4.取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5.弃上清，按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7.用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种：
TaKaRaTaqTM，TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymerase。
TaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
PyrobestTMDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
如果进行基因的扩增请使用此酶。
1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：
TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方
Reagent
Quantity,for50µlofreactionmixture
10XPCRbuffer（Mg2+free）
5µl
MgCl2（25mM）
如TaKaRaTaqTM加3µl
如TaKaRaEXTaqTM加4µl
2.5mMdNTPmix
4µl
10µMPrimer上游
1µl
10µMPrimer下游
1µl
TemplateDNA
1µl
Taq或EXTaqDNAPolymerase
0.25µl
Steriledeionizedwater
Upto50µl
Total
50µl/Sample
PyrobestTMDNAPolymerase的配方
Reagent
Quantity,for50µlofreactionmixture
10XPyrobestbuffer
5µl
2.5mMdNTPmix
4µl
10µMPrimer上游
1µl
10µMPrimer下游
1µl
TemplateDNA
1µl
PyrobestTMDNAPolymerase
0.25µl
Steriledeionizedwater
Upto50µl
Total
50µl/Sample
1反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；
2将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
3如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；
2.按以下程序进行PCR扩增。
PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。
Step
Temperature,°C
Time,min
Numberofcycles
Note
起始变性
94~95
1-3
1
变性
94~95
0.5-2
25-35
退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
退火
37-70
0.5-2
延伸
70-75
根据扩增产物的大小
每分钟延伸1000bp
最终延伸
70-75
10
1
反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
RT-PCR
Protocol:
TaKaRaOneStepRNAPCRKit（AMV）
1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液
Reagent
Quantity,for50µlofreactionmixture
10×OneStepRNAPCRBuffer
5µl
25mMMgCl2
10µl
10mMdNTPmix
5µl
RNaseInhibitor（40U/µl）
1µl
AMV-OptimizedTaq
1µl
AMVRTaseXL（5U/µl）
1µl
上游特异Primer（20µM）
1µl
下游特异Primer（20µM）
1µl
实验样品RNA（≤1µgTotalRNA）
1µl
RNaseFreedH2O
24µl
Total
50µl/Sample
1.反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；
2.将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
3.如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；
2．按以下条件进行反应
Step
Temperature,°C
Time,min
Numberofcycles
Note
逆转录
50
30
1
逆转录酶失活
94
2
1
变性
94
0.5
25-35
退火
37-65
0.5
退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
延伸
72
根据扩增产物的大小
Taq酶每分钟延伸1000bp
最终延伸
72
10
1
反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
琼脂糖核酸电泳
1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；
2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：
准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30ml）；
3.放入到微波炉内加热熔化。
冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。
一般60～100V电压，电泳20～40min即可；
8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5%
1,000～30,000
0.7%
800～12,000
1.0%
500～10,000
1.2%
400～7,000
1.5%
200～3,000
2.0%
50～2,000
胶回收纯化DNA
1.琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；
2.按照每100mg加400µl的量加入bindingbuffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；
3.取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；
4.加500µl的washbuffer至柱中，8,000rpm离心1分钟。
弃管中的溶液；
5.重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的washbuffer；
6.将纯化柱放入一个新的EP管。
加30~40µlH2O或者elutionbuffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7.注：
若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的bindingbuffer,其余的步骤不变。
大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）
此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。
1.取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；
2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0）中，剧烈振荡；
3.加入200µl新配制的溶液II（0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）），盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；
4.加入150µl预冷溶液III（每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mlH2O），盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；
5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；
6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；
7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；
8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解；
9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟；
10.电泳鉴定。
乙醇沉淀DNA
1.加入1/10体积的乙酸钠（3mol∕L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol∕L；
2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟；
3.12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；
6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。
酶切
1.酶切前确定待切样品的浓度,并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
2.在离心管中加入如下成分：
10×Buffer1μl
待切样品xμl
酶0.5-1μl
加水补足10μl
3.混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
4.将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。
5.用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
注：
当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。
双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。
）
连接
1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
2.在离心管中加入如下成分：
10×连接Buffer1μl
待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）
连接酶0.5-1μl
加水补足10μl
3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而定，一般为22℃1-3hr或16℃连接过夜）。
连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。
感受态细胞的制备
1.挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18℃剧烈震荡，直到A600达到0.6。
3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃4,000rpm/min离心10min。
同时在冰浴上配置TB溶液。
4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB（1/3体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min离心10min。
6.弃上清，沉淀重悬于4mlTB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。
7.加入280μlDMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。
8.将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。
9.取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。
阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
SOB的配制：
蛋白胨20g
酵母提取物5g
NaCl0.58g
KCl0.186g
100×Mg++溶液10ml
溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌
100×Mg++溶液：
MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌
TB溶液的配制：
1MKCl5ml
0.55MMnCl22ml
0.5MCaCl20.6ml
0.1MK-Pipes（pH6.7）2ml
ddH2O10.4ml
Total20ml
注：
上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理
0.1MK-Pipes（pH=6.7）的配制：
称取3.02gPipes粉末溶于80mlddH2O中，此时粉末不能完全溶解，用10NKOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。
转化
1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2min。
4.加入0.9mlSOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。
5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。
i.注：
新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。
ii.当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl1MIPTG和40μl20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。
重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。
1.用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。
2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min离心，弃上清，加入20μlddH2O和20μl酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min离心。
3.取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4.用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5.选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl体系。
酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6.酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。
7.若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0μl菌液为模板进行PCR反应，每管反应体系最低可少至10μl，PCR产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
真核细胞的转染
该操作以Invitrogen公司的脂质体转染试剂LipofectAMINE为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。
1.在6孔板中接种1-3×105细胞/孔，加入2ml完全培养基，置CO2孵箱中37℃培养过夜。
2.待细胞长到50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液：
i.溶液A：
将1-2μg待转染的超纯DNA稀释到100μl无血清培养基中
ii.溶液B：
将2-25μlLipofectAMINE稀释到100μl无血清培养基中
3.混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15-45min。
4.用2ml无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8ml无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr。
5.用完全培养基替换转染液，继续培养。
6.24-72hr后检测蛋白质的表达或传代并加入选择性抗生素以筛选稳定表达株。
转染细胞的稳定筛选
1．确定抗生素作用的最佳浓度：
不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。
1）提前24小时在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2孵箱中37℃培养过夜。
2）将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0,50,100,200,400,600,800和1000μg/ml）。
3）培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.
2．转染按前面的步骤进行。
3．转染72小时后按1:
10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。
在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。
1）滤纸片法：
用消毒的5x5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。
细胞在24孔板中长满后转入25cm
培养瓶中,长满后再转入75cm
培养瓶中培养。
2）有限稀释法：
将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2—10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，7-10天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
4.ELISA或Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量
按Qiagen公司的操作手册进行，具体步骤如下。
一、重组蛋白质的诱导表达
1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于3ml选择性LB液体培养基中，37oC，250rpm/min振摇培养过夜。
2.次日将培养过夜的菌液500μl再接种于10ml（1:
20）选择性LB液体培养基中，37oC，250rpm/min振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取1ml样本作为诱导前标本，10000g离心1min收集菌体沉淀，－20oC冻存备用。
3.加入1mol/LIPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1mM，37oC，250rpm/min振摇培养4～5小时。
取1ml样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20oC冻存备用。
4.将诱导前后菌体沉淀用20~40μlPBS（pH=8.0）重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5min，SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。
5.选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20oC保存，准备做下一步分析及纯化。
二、重组蛋白质的分离纯化
重组蛋白质的可溶性鉴定
1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液1（Lysisbufferundernativeconditions）中，然后在－80oC低温冰箱中放置10min。
2.冰中解冻。
3.在冰浴上用超声破碎仪破菌6次，每次10sec，间歇10sec，电压200-300V。
4.10000g，4oC，离心20min，取上清（为溶液A），－20oC保存；另将沉淀用同样裂解液1溶解（为溶液B），同样－20oC保存，供后继分析使用。
5.将上述A、B溶液和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。
如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在B溶液中，则为非可溶蛋白。
重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化
1.将菌体沉淀溶于适量裂解液2（Lysisbufferunderdenaturingconditions）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。
2.10000g，4oC，离心30min，收集上清液。
3.将Ni-NTAAgarose充填柱子，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTAAgarose，调节A280值至零线。
4.将适量上清液上样到Ni-NTAAgarose柱子中，并用lysisbuffer冲洗至A280值低于0.01。
5.分别用5～10倍柱体积的清洗液1和清洗液2（Washbuffer1and2）清洗柱子，直至A280值低于0.01。
6.用洗脱液（Elutionbuffer）洗脱重组蛋白质，在A280值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。
三、重组蛋白质的复性、冻干和定量
纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。
以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用BIO-RAD公司蛋白质定量试剂（proteinassay）比色测定蛋白质的含量。
肿瘤细胞体外传代培养及保种
一.细胞复苏与培养
将液氮或-80oC保存的肿瘤细胞于37oC水浴,快速溶化,用8.0ml培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液,于1500转/分,离心3分钟。
弃上清,再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀,再1500转/分,离心3分钟,弃上清,细胞沉淀用1.0ml培养基混匀,备用。
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