基因工程实验技术.docx

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基因工程实验技术

基因工程实验技术

目录

实验一、动物组织RNA提取

实验二、RT-PCR和表达引物扩增目的基因

实验三、核酸琼脂糖电泳检测、回收

实验四、目的片段的酶切

实验五、质粒载体的提取、酶切、

实验六、载体和外源DNA的连接

实验七、感受态细胞的制备及转化

实验八、克隆的筛选和快速鉴定

实验九、重组菌质粒提取及其在表达菌株中的转化

实验十、转化子鉴定及其诱导表达

实验十一、聚丙烯酰胺电泳检测

实验十二、WesternBlotting检测

1动物组织RNA的提取

1.1材料

小鼠肝或肌肉组织。

1.2设备

研钵，高速冷冻离心机，低温冰箱，电泳仪，电泳槽。

1.3试剂

1、无RNA酶灭菌水：

用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2、75%乙醇：

用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

3、无水乙醇

4、氯仿/异戊醇

1.4操作步骤

1.4.1RNA的提取-----------Trizol法

1、将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml的Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2、研磨液室温×5min，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置5min，12,000rpm×5min。

3、取上层水相于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温×10min，12,000rpm×10min。

4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃×7,500rpm×5min。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于30μLDEPCH2O中，必要时55℃-60℃水溶10min。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

6、电泳检测。

[注意]

1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

2RT-PCR扩增目的基因

2.1试剂

1、RNA模板2、cDNA引物

3、反转录缓冲液4、dNTP

5、M-MULV反转录酶6、RNA抑制剂（RNasin）

7、pfuDNA聚合酶8、TaqDNA聚合酶

9、10×PCRbuffer10、引物（P1、P2）

2.2设备

1、PCR扩增仪2、电泳仪

3、台式离心机4、恒温水浴

5、微量移液器

2.3操作步骤

2.3.1RNA的反转录

1、在小管中依次加入

RNA模板3.0μL

Olig（dT）18引物1.0μL

DEPCH2O8.0μL

混合，70℃×5min（破坏二级结构）后，冰浴×5min。

2、在管中依次加入

RT5×buffer4.0μL

RNasin1.0μL

dNTP（10mM）2.0μL

混匀，37℃×5min，

M-MULV反转录酶1.0μL

混匀，42℃×1h。

3、70℃5min（使酶失活）。

4、于-20℃保存备用。

2.3.2PCR扩增DNA

模板（反转录产物）1.0μL

10×PCR缓冲液3.0μL

dNTP1.0μL

引物11.0μL

引物21.0μL

Pfu（或Taq）DNA聚合酶1.0μL

ddH2O22.0μL

94℃3min

94℃1min

32cycles:

57℃1min

72℃1min30sec

72℃10min

PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析鉴定，割胶（割下相对应的片段942bp左右）,加入相应的溶胶液进行胶回收，然后取出1μL作为摸板，用表达引物进行PCR二次扩增。

2.3.3二次PCR

模板（回收DNA）1.0μL

10×PCR缓冲液3.0μL

dNTP1.0μL

表达引物11.0μL

表达引物21.0μL

Pfu（或Taq）DNA聚合酶1.0μL

ddH2O22.0μL

94℃3min

94℃1min

32cycles:

57℃1min

72℃1min30sec

72℃10min

3核酸琼脂糖电泳检测、回收

3.1试剂

1、TBE缓冲液（5×）：

用时需稀释5倍

2、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

0.25%溴酚蓝，40%甘油

3、溴乙啶染色液（EB）：

10mg/ml溴乙啶注意：

该试剂具致癌作用，用时要小心。

4、琼脂糖

3.2器材

1、电泳仪系统

2、凝胶成像系统

3.3操作步骤

3.3.1琼脂糖凝胶的制备

称1g琼脂糖加入100mlTBE缓冲液中加热熔解，冷却至60℃。

3.3.2胶板制备

将凝胶槽洗净擦干，倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，移至电泳槽，拔掉梳子。

注意：

缓冲液要高出胶面2mm。

3.3.3加样

每个样品中加入1/10体积Loadingbuffer（10×），混匀后小心加入样品槽中，避免相互污染。

3.3.4电泳

接通电源，电压为80V，电泳1h左右，当溴酚蓝到达下沿1~2㎝处时，停止电泳。

3.3.5观察及照相

将胶板拿出，在EB溶液中浸泡3-5min，用凝胶成像系统照相。

3.4琼脂糖凝胶电泳回收（方法见附录）

4目的片段的酶切

4.1取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂

加入试剂体积（μl）

灭菌水13.0

MULTbuffer5.0

目的基因30.0

EcoRⅠ1.0

HindⅢ1.0

总体积5０.0

4.237℃×１-２h。

4.3保温结束后，65-70℃×10min灭活酶（如为热稳定性酶,则用氯仿抽提）

注意：

１、样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒，

２、加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀

3、酶切结束要进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶进行产物的浓缩。

4、水解结束灭活酶时可采用65℃×10min或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。

EDTA对酶灭活彻底，但EDTA存在使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。

5PET-41a质粒的提取、酶切

5.1仪器超净工作台恒温水浴离心机摇床培养箱移液器电泳系统凝胶成像系统

5.2试剂

１、SolutionⅠ50mM葡萄糖,25mMTris-HCl（pH8.0）

10mMEDTA（pH8.0）,高压灭菌，4℃保存

２、SolutionII0.2MNaOH,1%SDS（现用现配）

３、SolutionIII5MKAC60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存

4、卡那霉素50mg/ml

5、酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）

5.3操作步骤

1、含卡那（50ug/ml）LB培养基培养菌体37℃×200rpm×过夜，将活化菌体按1-5％接种到含卡那（50ug/ml）LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。

2、４℃×10,000rpm×1min，取沉淀（充分去除LB培养液），加入预冷的100ulSolutionⅠ,充分振荡悬浮,

3、加入200ulSolutionII缓慢颠倒摇匀后，冰浴中3min,

4、加入150ul预冷SolutionIII缓慢颠倒混匀,冰浴5min,

5、4℃×12,000rpm×5min，取上清，

6、酚/氯仿/异戊醇、氯仿各抽提一次，4℃×12,000rpm×5min，

7、上清＋2V无水乙醇，-20℃×30min，

8、4℃×12000rpm×5min，取沉淀,

9、75%乙醇洗沉淀,冷冻干燥，

10、溶解于40μlddH2O或TE。

根据电泳检测质粒的质与量确定酶切体系进行双酶切（EcoRI+HindIII）,参照目的片段酶切。

注意:

质粒的酶切一定要充分,存在的超螺旋及开环状态都会影响到连接效果.

6载体和外源DNA的连接反应

6.1试剂

1、目标DNA片段（PCR扩增产物）

2、载体（PET-41a）

3、10×ligation缓冲液

4、T4DNA连接酶

5、ddH2O

6.2设备

1、台式离心机

2、恒温水浴

6.3操作步骤

取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂：

10×buffer：

1.0μl

PET-41a酶切产物：

1.5μl

目的片段酶切产物：

6.5μl

T4连接酶：

1.0μl

离心30Sec，使反应体系充分混合。

4℃过夜连接。

7感受态细胞的制备及转化

7.1.实验材料

大肠杆菌DH5α、BL21

7.1.1试剂

1、胰蛋白胨2、酵母提取物

3、氯化钠4、1mol/LNaOH

5、琼脂粉6、抗生素（卡那霉素、氯霉素、氨苄）

7、0.1mol/LCaCl2

7.1.2设备

1、培养皿2、带帽试管

3、涂布器4、恒温摇床

5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）

7.2操作步骤---------

7.2.1感受态细胞的制备（0.1MCaCl2方法）

1、从LB固体平板挑单克隆于5mlLB液体培养基中（DH5α不加抗生素，BL21需加Kan），37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。

2、将活化菌体按1-5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。

3、取培养好的菌液1.5ml于一离心管中，4℃离心8000rpm×1min。

4、弃上清，加250ul0.1MCaCl2（灭菌预冷）洗菌体，4℃×8000rpm×1min，重复1次。

5、彻底除去残液,加200ul0.1MCaCl2（灭菌预冷），悬浮菌体。

6、冰浴静置30min，4℃冷冻离心8000rpm×1min。

7、弃上清，加100ul0.1MCaCl2（灭菌预冷），悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。

附注：

⑴、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染

⑵、D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。

OD600值在0.4-0.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20分钟内加倍。

⑶、注意无菌操作和保持低温。

⑷、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

⑸、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

7.2.2、质粒对大肠杆菌的转化

1、将连接产物加入100ul制备好的感受态细胞，冰上放置30min。

2、42℃热激90S。

3、迅速冰浴3min。

4、加入1000ulLB液体培养基，37℃轻摇培养45min，3000rpm×1min，弃去上清。

5、取300ulLB液体培养基融解菌体，均匀涂布在含kan的LB固体培养基中。

7、37℃倒置培养16-20h。

8、挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。

8克隆的筛选和快速鉴定

8.1试剂

1、TaqDNA聚合酶

2、10×buffer（含MgCl2）

3、dNTP

4、Loadingbuffer

8.2设备

1、电泳仪

2、1.5ml离心管

3、培养皿

4、PCR扩增仪

5、台式离心机

8.3操作步骤

8.3.1提取质粒测定

1、取一培养皿在底部标记如图所示：

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456

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101112

2、待转化的细菌菌落长到2mm时用牙签挑取单克隆将菌落点在作好标记的方格内，然后将牙签加入对应的培养管中（培养管中含5mlLB液体培养基）。

3、培养皿37℃培养6h后4℃保存。

培养管37℃培养12h左右。

4、用培养管中的菌液提取质粒。

5、酶切电泳检查质粒或进行质粒PCR鉴定。

8.3.2菌落PCR鉴定法

1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入30μLPCR反应体系中。

2、用特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向

试剂

体积（30μL）

ddH2O

23.0μL

10×buffer

3.0μL

dNTP

1.0μL

表达Primer1

1.0μL

表达Primer2

1.0μL

模板

1个菌落

Taq酶

1.0μL

注：

PCR设置参照实验2，选取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒参照实验5。

9重组菌质粒提取及其在表达菌株（BL21）中的转化注：

参照实验5、实验7。

10转化子鉴定及其诱导表达

10.1试剂

1、IPTG2、Kan3、氯霉素4、LB液体培养基

10.2仪器

1.、恒温摇床2、台式离心机3、恒温水浴锅

10.3操作步骤

1、分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入1ml含Kan（50μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。

2、取50μL过夜培养物接入5ml含Kan（50μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（OD600=0.4~0.5）。

3、向诱导管中加入IPTG使其浓度达到1mmol/L，37℃振荡培养8h左右取样。

4、取500μL培养液，10,000rpm×3min，弃上清，沉淀用1×SDS上样缓冲液悬浮，100℃沸水浴×10min。

5、10,000rpm×1min，置冰上用来电泳点样。

11聚丙烯酰胺电泳检测

11.1试剂

1、30%丙烯酰胺溶液：

丙烯酰胺29.0g，甲叉双丙烯酰胺1.0g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。

2、1.5mol/LTris-HCl分离胶缓冲液pH8.8（4×）：

取18.15gTris，用1MHCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。

3、0.5mol/LTris-HCl浓缩胶缓冲液，pH6.8（8×）：

取11.96gTris，用1NHCl调至pH6.8，加水至100ml，4℃保存。

4、电极缓冲液（pH8.3）：

取14.49g甘氨酸，3.02gTris，加100ml10%SDS，加水至1升，4℃保存。

5、10%SDS：

取10gSDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。

6、10%过硫酸铵溶液（AP）：

（临用前现配）

7、染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、7%乙酸）：

考马斯亮蓝R-2502.5g、甲醇（可用无水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸，溶解后补足水至总体积1000ml。

8、脱色液（30%甲醇,7%乙酸）:

甲醇（或无水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml，补足水至1000ml。

9、样品缓冲液（2x）：

H2O2.4ml，浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰0.2ml。

10、TEMED（四甲基乙二胺）

11.2设备

1、离心机2、电泳

11.3电泳

1、准备步骤

将凝胶板水洗涤干净，使其自然风干或烘干。

梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在灌胶架上。

按下表配制适合浓度的分离胶，摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，小心在胶上覆盖一层95%的乙醇。

10%（ml）

H2O

4.10

29%Acr+1%Bis

3.34

4×分离胶缓冲液（pH8.8）

2.50

10%SDS

0.05

TEMED

0.02

10%过硫酸铵

0.02

总体积

10ml

在分离胶聚合过程（约30分钟）中，按下表配制5%浓缩胶，注意TEMED应在灌胶前才加入。

H2O

3.675（ml）

29%Acr+1%Bis

0.65

8×浓缩胶缓冲液（pH6.8）

0.625

10%SDS

0.05

TEMED

0.05

10%过硫酸铵

0.05

总体积

5ml

分离胶聚合完全后，倒去乙醇，用滤纸吸干胶面上的残余水。

灌注浓缩胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。

浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。

将胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入电极缓冲液。

2、上样

用微量进样器加样，每个点样孔中加入20ul样品，同时点蛋白marker。

每次应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。

3、电泳

装好冷凝水系统，打开电源，电压为100V，电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。

4、染色：

从电泳装置上卸下胶板，小心橇开玻板取出凝胶，将胶板放入考马斯亮蓝R250染色液中染色2小时以上。

5、脱色：

移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。

根据电泳结果分析诱导菌株有无表达目的基因。

12WesternBlotting

12.1试剂

1、转移缓冲液：

3.03gTris、14.4g的Glycine、200ml甲醇、定容到1L。

2、TBS：

0.1M的Tris、0.9%的NaCl、pH7.5

3、TTBS：

TBS中含0.1%的Tween-20

4、预染的蛋白marker

5、硝酸纤维素膜

6、脱脂奶粉

7、anti-GST单克隆抗体

8、goat-anti-mouse-IgG-AP

9、BCIP-NBT

12.2设备

1、电转印设备

12.3操作步骤

1、将电泳后的胶板取出，裁取和胶等大的硝酸纤维素膜，按照：

海绵-滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序装入电转印槽中，注意硝酸纤维素膜一定要朝向正极一侧。

2、加入转膜缓冲液，放在冰水浴中60V电压（150mA）转印2h。

（整个过程应带手套操作）

3、取出硝酸纤维素膜用TBS冲洗一次。

室温下，在脱色摇床上用含10%脱脂奶粉的TBS封闭硝酸纤维素膜1h。

倒掉封闭液，用TTBS洗膜10min。

4、取1μlanti-GST单克隆抗体（一抗），稀释在500μl含少量脱脂奶粉的TTBS中，将稀释的一抗均匀点在一干净手套上，要求面积同硝酸纤维素膜等大。

小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在一抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。

25℃放置2h。

5、用TTBS洗膜2~3次，大约需要持续30min。

6、取1μlgoat-anti-mouse-IgG-AP（二抗），稀释在500μl含少量脱脂奶粉的TTBS中，同样，将稀释的二抗均匀点在一干净手套上。

小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在二抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。

25℃放置1h。

7、TTBS洗膜4~5次，将硝酸纤维素膜装入杂交袋中，加入用AP缓冲液稀释的BCIP-NBT显色，当有清晰的兰色条带出现时，用水冲洗硝酸纤维素膜，观察并分析结果，干燥保存。

附录：

DNA回收试剂盒说明

1、切取含DNA片断的琼脂糖（100-300mg）用吸头捣碎，按1：

3加入溶液A（M/V）。

2、50℃×10min，振荡助融2-3次，使胶完全融化，室温加入15ul溶液B，充分混匀。

3、将溶液置于离心柱中，静置2min，8,000rpm×20-30Sec，弃上清。

4、加入500ul溶液C于离心柱中，8,000rpm×20-30Sec，弃上清。

5、重复步骤4。

6、12,000rpm×1min，甩干剩余液体以及除去残余酒精。

7、将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10分钟，使乙醇挥发殆尽。

8、加入20-30ul溶液D，50℃×2min。

9、12,000rpm×1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于－20℃可长期保存。