第三章植物组织培养基本技术.docx
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第三章植物组织培养基本技术
第三章植物组织培养基本技术
植物组织培养是一项技术性和实践性强、无菌条件要求高的一项工作。
掌握组织培养的工作程序和基本操作技术，是做好组织培养工作的基本要求。
因此，我们在组织培养的学习和实践中应不断提升操作水平，掌握技术要领和相关理论知识，这样才能更好地按照工作程序的要求，高质量开展组织培养的试验研究和苗木生产。
第一节组培的一般工作程序
植物组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代培养、壮苗与生根培养、试管苗的驯化移栽等几个技术环节（图3-1），各技术环节的具体要求见本章第2～6节内容。
第二节培养基及其配制
培养基是提供植物生长发育所需各种养分的介质。
在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。
因此，理解培养基的组成及其作用，掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。
一、培养基配制的目的
完整植株具根、茎、叶等器官，它们彼此分工协作，通过新陈代谢从环境中吸收营养，以自养方式建造自身。
离体培养材料缺乏完整植株那样的自养机能，需要以异养方式从外界直接获得其生长发育所需的各种养分。
配制培养基的目的就是人为提供离体培养材料的营养源，包括碳水化合物、矿质营养、维生素等，以满足离体材料的生长发育。
按照不同配方配制的培养基，是为满足不同类型离体材料的营养需要。
二、培养基的成分
培养基的成分主要包括水、无机盐、有机物、植物激素、培养物的支持材料五大类。
（一）水分
水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
配制培养基时选用蒸馏水或去离子水，不但可以保持培养基配制的准确性。
另外，也有利于减少发霉变质，延长培养基母液的贮藏时间。
大规模生产时，配制培养基可用自来水代替蒸馏水。
（二）无机盐
根据植物对无机盐需求量的多少，可分为大量元素和微量元素。
1.大量元素
大量元素是指植物生长发育所需的浓度小于0.5mmol/L的营养元素，主要有N、P、K、Ca、Mg、S等。
其中，N是植物矿质营养中最重要的元素，分为硝态氮（NO3－）和铵态氮（NH4+），这两种状态的氮都是植物组织培养所需要的。
当作为惟一的氮源时，硝态氮的作用要比铵态氮好得多，但在单独使用硝态氮时，培养一段时间后培养基的pH值会向碱性方向转变，若在硝酸盐中加入少量铵盐，则会阻止这种转变。
缺磷时植物细胞的生长和分裂速度均会降低。
K、Ca、Mg等元素能影响植物细胞代谢中酶的活性。
2.微量元素
微量元素是指植物生长发育所需的浓度小于0.5mmol/L的营养元素，主要有Fe、Mn、Cu、Mo、Zn、Co、B等。
它们用量虽少，但对植物细胞的生命活动却有着十分重要的作用。
其中，Fe是用量较多的一种微量元素，对叶绿素的合成和延长生长等起重要作用。
Fe元素不易被植物直接吸收且易出现沉淀。
因此，通常在培养基中加入以FeSO4·7H2O和Na2-EDTA（螯合剂）配制成的螯合态铁（Fe－EDTA）可以减轻沉淀和提高利用率。
无论是大量元素和微量元素，都是离体组织生长发育必不可少的基本的营养成
分，含量不足时都会造成缺素症。
（三）有机化合物
1.糖类
糖类提供外植体生长发育所需的碳源、能量，使培养基维持一定的渗透压。
蔗糖是最常用的糖类，可支持许多植物材料良好生长。
其使用浓度一般为２%～5％，常用３％，但在胚培养时可高达15％，因蔗糖对胚状体的发育起着重要作用。
在大规模生产时，可用食用白糖代替，以降低生产成本。
2.维生素类
完整植株在生长过程中能自身合成各种维生素，可满足自身各种代谢活动的需
要。
但在离体培养中则不能合成足够的维生素，需要另加一至数种维生素，才能维持正常生长。
常用的维生素有VB1、VB6、VPP、VC等，一般用量为0.1～1.0mg/L。
除叶酸需要用少量氨水先溶化外，其他维生素均能溶于水。
VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用；在低浓度的细胞分裂素下，特别需要添加VB1、VB6才能促进根的生长；VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系；VC有防止组织褐变的作用。
3.肌醇
肌醇又叫环己六醇，能够促进糖类物质的相互转化和活性物质作用的发挥，以及能够促进愈伤组织的生长、胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化也有促进作用。
另外，对细胞壁的形成也有作用。
但肌醇的用量过多，则会加速外植体的褐化。
肌醇使用浓度一般为100mg/L。
4.氨基酸
氨基酸是良好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用，在培养基中含有无机氮的情况下，更能发挥其作用。
常用的氨基酸有甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物（如水解乳蛋白和水解酪蛋白）等。
5.天然有机复合物
组织培养所用的天然有机复合物的成分比较复杂，大多含氨基酸、激素等一些活性物质，因而能明显促进细胞和组织的增殖与分化，尤其是对一些难以培养的材料有特殊作用。
常用的天然有机复合物有椰乳、香蕉泥、马铃薯提取物、酵母提取液、苹果汁、番茄汁等。
由于这些复合物营养非常丰富，所以培养基配制和接种时一定要十分小心，以免引起污染。
（四）植物激素
植物激素是培养基的关键性物质，对植物组织培养起着决定性的作用。
1.生长素类
①种类与活性强弱常用的有IAA、IBA、NAA、2，4-D，其活性强弱为2，4-D>NAA>IBA>IAA，一般它们的活性比为：
IAA∶NAA∶2，4-D=1∶10∶100。
②作用主要用于诱导愈伤组织形成，促进根的生长。
此外，协助细胞分裂素促进细胞分裂和伸长。
③稳定性和溶解性除了IAA不耐热和光，易受到植物体内酶的分解外，其他生长素激素对热和光均稳定。
[endif]>生长素类溶于酒精、丙酮等有机溶剂。
在配制母液时多用95%酒精或稀NaOH溶液助溶。
一般配成0.1mg/ml～0.5mg/ml的母液贮于冰箱中备用。
2.赤霉素（GA）
①作用主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。
赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质化，比值低时有利于韧皮化。
另外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。
一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
②稳定性和溶解性赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95%酒精助溶。
它与IAA一样不耐热，需在低温条件下保存，使用时采用过滤灭菌法加入。
如果高温高压灭菌赤霉素将有70～100%失效。
3.细胞分裂素类
①种类及活性强弱这类激素是腺嘌呤的衍生物，常见的有6-BA、KT、ZT、2-ip等。
其活性强弱为2-ip>ZT>6-BA>KT。
②作用在植物组织培养中，细胞分裂素的主要作用是抑制顶端优势，促进侧芽的生长。
当组织内细胞分裂素／生长素的比值高时，有利于诱导愈伤组织或器官分化出不定芽；促进细胞分裂与扩大，延缓衰老；抑制根的分化。
因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖。
③稳定性与溶解性所有的细胞分裂素对光、稀酸和热均稳定，但它的溶液在常温中时间长了会丧失活性。
细胞分裂素能溶解于稀酸和稀碱中，在配制时常用稀HCl助溶。
通常配制成1mg/ml的母液，贮藏在低温环境中。
（五）培养物的支持材料
1.琼脂
琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供给培养物任何营养。
它是固体培养时最好的固化剂。
2.其它
玻璃纤维、滤纸桥等均可替代琼脂。
其中，滤纸桥法（图3-2）在解决生根难的问题上经常采用。
其方法是将一张较厚的滤纸折叠成M型，放入液体培养基中，再将培养材料放在M形的中间凹陷处，这样培养物可通过滤纸的虹吸作用不断从培养液中吸收营养和水分，又可保持有足够的氧气。
（六）活性炭
加入活性炭的目的主要是利用其吸附性，减少一些有害物质的不利影响，如能够吸附一些酚类物质，可减轻组织的褐化（在兰花组培中作用效果明显）。
此外，创造暗环境，有利于某些植物的生根。
另据报道，活性炭能恢复胡萝卜悬浮培养细胞的胚状体发生能力；0.3%活性炭能降低玻璃化苗的发生率。
（七）抗生素
抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量为5～20mg/L。
添加抗生素可防止菌类污染，减少培养过程中材料的损失，节约人力、物力和节省时间。
三、培养基的种类与特点
（一）培养基的种类
虽然培养基的种类名称很多，但只要抓住划分的依据就容易理解和记忆。
根据态相不同，培养基可分为固体培养基与液体培养基。
固体培养基与液体培养基的区别是在培养基中是否添加了凝固剂。
根据培养阶段不同，可分为初代培养基、继代培养基。
根据培养进程和培养基的作用不同，分为诱导（启动）培养基、增殖（扩繁）
培养基及壮苗生根培养基。
根据其营养水平不同，分为基本培养基和完全培养基。
基本培养基即平常所说的培养基，如MS、White培养基。
完全培养基由基本培养基和添加适宜的激素和有机附加物组成。
对培养基的某些成分进行改良而成的培养基称为改良培养基。
（二）常用培养基的特点
虽然培养基有许多类型，但在组培试验和生产中应根据植物种类、培养部位和培养目的的不同而选用不同的培养基。
因为不同的培养基具有不同的特点及适用范围。
常用的培养基配方及特点见表3-1和表3-2。
表3-1几种常用培养基配方
化合物名称
培养基含量/mg·L-1
MS
White
B5
WPM
N6
KnudsonC
Nitsch
NH4NO3
1650
720
KNO3
1900
80
2527.5
400
950
（NH4）2SO4
134
2830
500
NaNO3
463
KCl
65
CaCl2·2H2O
440
150
96
166
166
Ca（NO3）2·4H2O
300
556
1000
MgSO4·7H2O
370
720
246.5
370
185
250
185
K2SO4
900
Na2SO4
200
KH2PO4
170
170
400
250
68
K2HPO4
FeSO4·7H2O
27.8
27.8
27.8
25
27.85
Na2－EDTA
37.3
37.3
37.3
37.75
Na2-Fe-EDTA
28
Fe2（SO4）3
2.5
MnSO4·H2O
22.3
MnSO4·4H2O
22.3
7
10
4.4
7.5
25
ZnSO4·7H2O
8.6
3
2
8.6
1.5
10
CoCl2·6H2O
0.025
0.025
0.025
CuSO4·5H2O
0.025
0.03
0.025
0.025
MoO3
0.25
Na2MoO4·2H2O
0.25
0.25
KI
0.83
0.75
0.75
0.8
10
H3BO3
6.2
1.5
3
6.2
1.6
NaH2PO4·H2O
16.5
150
烟酸（Vpp）
0.5
0.5
1
0.5
0.5
盐酸吡哆醇
0.5
0.1
1
0.5
0.5
盐酸硫胺素
0.1
0.1
10
0.5
1
肌醇
100
100
100
100
甘氨酸
2
3
2
2
pH
5.8
5.6
5.5
5.8
5.8
5.8
6.0
表3-2常用基本培养基的比较
基本培养基
特点
适用范围
设计者及时间
MS
无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。
其中钾盐、铵盐和硝酸盐含量较高
广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养
1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计
B5
含有较高的钾盐和盐酸硫胺素，但铵盐含量低，这可能对有些培养物的生长有抑制作用。
南洋杉、葡萄等木本植物及豆科、十字花科植物的培养
1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计
White
无机盐含量较低，但提高了MgSO4的浓度和增加了硼素
生根培养
1943年由White为培养番茄根尖而设计，
N6
成分较简单，但KN03和（NH4）2S04含量高。
小麦、水稻及其他植物的花药培养等
1975年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计
KM-8P
有机成分较复杂，包括了所有的单糖和维生素
禾谷类和豆科植物的原生质融合的培养
1975年由Kao等为原生质体培养而设计
WPM
硝态氮和Ca、K含量高，不含碘和锰
木本植物的茎尖培养
1933年由MecownLioyd设计
Knudson
成分简单，不能满足大多数植物组织细胞的生长发育所需的营养物质
兰科植物种子培养和萌发
1925年由Knudson为兰科种子培养而设计
四、培养基的配制
（一）配制母液的目的
在植物组织培养的过程中，配制培养基是日常必做的工作。
通常先将各种药品配制成浓缩一定倍数的母液（又称为浓缩贮备液）。
母液根据化学性质分别配制。
一般配成大量元素母液（浓缩10倍）、微量元素母液（浓缩100倍）、铁盐母液（浓缩100倍）和有机物母液（浓缩50～100倍）。
配制母液不但节省配制时间，而且能够保证配制的准确性和配制时的快速移取，极大提高了工作效率。
此外，也便于培养基的低温保藏。
（二）母液和培养基的配制方法
母液和培养基的配制方法分别见技能3-2和技能3-3。
五、培养基的筛选
培养基和培养条件是影响植物组织培养效果的两大重要因素。
在组培苗大规模生产前，必须经过培养基和培养条件的筛选这一技术环节。
只有经过试验筛选、验证确属最佳后才可以在生产上应用。
以下介绍培养基的筛选方法。
至于培养条件的筛选与培养基的筛选方法大体相似。
一般最佳培养基的筛选途径如图3-3所示。
（一）试验前的准备工作
1.文献检索
在进行某种植物组织培养之前，需要通过查阅相关文献来了解培养对象的有关
信息。
查找文献的途径主要有：
①从专业杂志或有关杂志上查阅；②从互联网上查找，特别是从收费的数据网上查找，资料和数据比较丰富，非常方便，效率高；③从报纸或电视等媒体上获取。
2.参观咨询
有时查找文献不方便，这时可通过参观组培育苗工厂或研究机构，向专业人员请教植物组培的试验方案。
参观咨询可能较自己查阅文献来得更直接和更便捷。
（二）预备试验
所谓预备试验就是指正式试验开始之前根据试验设计进行的过渡试验，为正式试验的开展所做的前期摸索。
预备试验要求较低，往往凭经验进行试培养，然后观察培养物的反应，有反应的可接着做。
即使否定性的结果也能从中获得有用的信息。
（三）常用的试验方法
1.单因子试验
单因子试验是指整个试验中保证其他因素不变，只比较一个试验因素的不同水平的试验。
其试验方案由该试验因素的所有水平构成。
这是最基本、最简单的试验方法。
例如不同浓度NAA对生根影响的试验就是一种单因子试验。
试验中要求对照组与试验组中的植物组织块或其他培养物必须在遗传性、生理状态、培养条件等方面尽可能完全一致，以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。
2.双因子试验
双因子试验是指在整个试验中其他因素不变，只比较两个试验因素的不同水平的试验。
如研究NAA、6-BA两种因子对薰衣草增殖率的影响时，可以按表3-3设计试验。
从表中可以看出，NAA与6-BA各有三种水平的组合，A表示向培养基中同时添加NAA0.1mg/L与6-BA1mg/L，H表示NAA2mg/L与6-BA2mg/L的组合添加，其余类推。
表3-3双因子试验方法
6-BA/mg．L-1
1
2
5
NAA/mg．L-1
0.1
A
B
C
0.5
D
E
F
2
G
H
I
3.多因子试验
是指在同一试验中同时研究两个以上试验因子的试验。
多因子试验方案由该试验的所有试验因子的水平组合（即处理）构成。
此种方法可用于同时探讨培养基中多种成分的适宜用量，如KT、糖类、NAA的用量等。
多因子试验方案分为完全方案和不完全方案两类。
前者在试验因子和水平较多时，会费时费力，且试验误差不易控制，故很少有人使用；而后者是在全部水平组合中凭经验挑选部分水平组合所获得的设计方案，工作效率高，故为多数人所采用。
其中，正交试验用得最多，它是安排多因子试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。
所谓正交试验是指利用正交表来安排与分析多因子试验的一种设计方法（表3-4）。
表头中的“L”代表正交表；L右下角的数字“8”表示有8行，用这张正交表安排试验包含8个处理（水平组合）；括号内的底数“2”表示因子的水平数，括号内2的指数“7”表示有7列，用这张正交表最多可以安排7个因子。
常用的正交表已由数学工作者制定出来，供正交设计时选用（详见相关书籍）。
表3-4L8（27）正交表
试验号
列号
1
2
3
4
5
6
7
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
2
2
2
2
3
1
2
2
1
1
2
2
4
1
2
2
2
2
1
1
5
2
1
2
1
2
1
2
6
2
1
2
2
1
2
1
7
2
2
1
1
2
2
1
8
2
2
1
2
1
1
2
任何一张正交表都具有如下两个特性：
① 任一列中，不同数字出现的次数相等例如L8（27）中不同数字只有1和2，
它们各出现4次；L9（34）中不同数字有1、2和3，它们各出现3次。
②任两列中，同一横行所组成的数字组合出现的次数相等，例如L8（27）中（1,1）,
（1,2）,（2,1）,（2,2）各出现两次；即每个因素的一个水平与另一因素的各个水平互碰次数相等，表明任意两列各个数字之间的搭配是均匀的。
正交试验虽然是多因子组合在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。
因此，根据一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，取得事半功倍的试验效果。
4.逐步添加和逐步排除的试验方法
在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添
加各种有机营养成分，以促使试验成功；而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分，以便找到最有影响力的因子，或从经济实用上考虑，简化培养基，以降低成本和利于推广。
在寻求最佳激素配比时，经常用到这种逐步添加与逐步减少的简单方法。
第三节外植体的选择与处理
植物组织培养的成败除与培养基、培养条件的正确选择有关外，另一个重要因
素就是外植体本身，即由活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。
外植体选择是否适宜，以及对其处理的方法是否得当，直接关系到组织培养的难易程度和培养方向。
因此，掌握外植体的选择原则及其处理方法是十分重要的。
一、外植体的选择原则
从理论上讲，任何活的含完整细胞核的植物细胞都具有全能性，只要条件适宜，都能再生成完整植株。
所以，外植体可以是植物细胞、组织或器官，甚至是原生质体。
由于不同植物种类以及同种植物的不同器官对诱导条件的反应是不一致的，有的部位诱导成功率高，有的部位很难脱分化，有的即使脱分化，再分化频率也很低，出芽不长根，或长根不长芽。
因此，生产实践中必须选取最易表达全能性的部位，以降低生产成本。
一般多选择茎段、茎尖、叶片、花药等作为组培快繁的外植体。
选择外植体主要从植物的基因型、生理状态、取材季节、取材部位等考虑。
1.植物基因型
植物组织培养的难易程度与植物的基因型相关。
一般来说，草本植物易于木本植物；双子叶植物易于单子叶植物。
因此，选取优良的或特殊的具有一定代表性的基因型，可以提高组织培养的成功率，增加其实用价值。
2.生理状态
外植体的生理状态和发育年龄直接影响植物离体培养过程中的形态发生。
越幼嫩、年限越短的组织越具有较高的形态发生能力，组织培养越易成功。
3.取材季节
外植体最好在其生长开始的季节选取，若在生长末期或已经进入休眠期选取，
则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。
如百合鳞片外植体，春、秋季取材容易形成小鳞茎，夏、冬季取材培养则难形成小鳞茎。
4.植物的长势
生长健壮的器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养容易成功。
5.取材部位
在确定取材部位时，一方面要考虑培养材料的来源是否有保证和容易成苗；另
一方面要考虑经过脱分化产生的愈伤组织的培养途径是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
对于培养较困难的植物，在培养材料较多的情况下，最好比较各部位的诱导及分化能力，既保质又保量。
6.外植体大小
选择外植体的大小，应根据培养目的而定。
如果是胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小；如果是进行快速繁殖，外植体宜大。
但外植体过大，消毒往往不彻底，易造成污染；过小则离体培养难于成活。
一般外植体大小在0.5～1.0cm为宜。
具体说叶片、花瓣等约为5mm×5mm，茎段长约带1～2个节，茎尖分生组织带1～2个叶原基，大小约0.2～0.5mm等。
二、外植体的处理
（一）外植体处理的基本过程
从田间取回的离体材料，往往带有较多的泥土、杂菌，不宜直接接种，需要对材料进行预处理和必要的修整。
外植体处理工艺流程见图3-4，具体操作见技能3-4。
（二）材料消毒原则
材料接种前必须进行表面消毒。
由于植物种类、取材部位、母体植株的生态环境、取材季节和天气状况的不同，所采集的材料带菌程度也不同，而且材料对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。
所以，选择哪种消毒剂、浓度大小和消毒时间的长短一定要有针对性，这样才有可能达到预期的消毒效果。
为此，需要掌握的消毒原则是既要杀死离体材料表面的全部微生物，又不损伤或只轻微损伤植物材料。
（三）常用的消毒剂
作为好的消毒剂既要有良好的消毒作用，又要容易被无菌水冲洗掉或能自行分
解。
此外，还不会损伤材料，影响细胞的生长。
目前使用的消毒剂的种类较多，实践中可根据情况从表3-5中选取1～2种。
表3-5常用消毒剂的使用浓度及消毒效果的比较
灭菌剂
使用浓度
消毒时间/min
去除的难易
效果
酒精
过氧化氢
漂白粉
次氯酸钙
70%～75%
10%～12%
饱和溶液
9%～10%
0.5～2
5～10
5～30
5～30
易
最易
易
易
好
好
很好
很好
次氯酸钠
0.7%～2%
5～30
易
很好
氯化汞
0.1%～0.5%
3～10
较难
最好
抗菌素
4～50mg/L
30～60
中
较好
第四节灭菌技术
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