植物的组织培养技术.docx
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植物的组织培养技术
植物的组织培养技术
课题一菊花的组织培养
1、植物组织培养的基本过程
脱分化再分化生长
外植体————→愈伤组织————→丛芽（胚状体）（试管苗）
理论基础：
植物细胞的全能性
★愈伤组织的细胞：
排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
2、植物组织培养技术的应用有：
实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。
3、影响植物组织培养的条件
①材料：
不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。
植物材料的选择直接关系到试验的成败。
植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。
菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。
②营养：
离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。
常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。
③激素：
植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。
在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。
在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。
使用顺序
实验结果
先生长素，
后细胞分裂素
有利于分裂但不分化
先细胞分裂素，
后生长素
细胞既分裂也分化
同时使用
分化频率提高
生长素／细胞分裂素比值与结果
比值高时
促根分化，
抑芽形成
比值低时
促芽分化，
抑根形成
比值适中
促进愈伤组织生长
植物组织培养中,为什么一般先诱导生芽后诱导生根,而不是反过来?
顶芽可以产生生长素促进生根.其实根冠也可产生生长素,却不能促进生芽,因为植物生长素运输方式比较特别，由形态学上端运送到形态学下端。
另一方面，生芽后产生绿叶，光合作用可为植物提供养料。
④环境条件：
PH、温度、光等环境条件。
不同的植物对各种条件的要求往往不同。
进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h.
4、操作流程：
配制MS固体培养基—→外植体的消毒—→接种—→培养—→移栽—→栽培
课题二月季的花药培养
一、被子植物的花粉发育：
花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。
被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期（单核居中期→单核靠边期）和双核期等阶段。
二、产生花粉植株的两种途径（即通过花药培养产生花粉植株单倍体植株）：
①一种是花粉通过脱分化形成胚状体，然后分化发育为植物；
②另一种是花粉在诱导培养基上脱分化先形成愈伤组织，再将其再分化成植株。
注意：
这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
注意：
①无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根
②胚状体：
植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为体细胞胚。
三、影响花药培养的因素：
诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低受多种因素影响，其中材料的选择是主要的影响因素。
花药早期比后期更容易产生花粉，一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。
另外，亲本植株的生长条件、接种密度等对诱导成功率都有一定影响
四、实验操作：
①材料的选取：
选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。
确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。
但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
②材料的消毒
③接种和培养
④鉴定和筛选。
五、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：
培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。
两者的不同之处在于：
花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。
这些都使花药培养的难度大为增加。
例题1．（16分）
拟南芥的A基因位于1号染色体上，影响减数分裂时染色体交换频率，a基因无此功能；B基因位于5号染色体上，使来自同一个花粉母细胞的四个花粉粒分离，b基因无此功能。
用植株甲（AaBB）与植株乙（AAbb）作为亲本进行杂交实验，在F2中获得了所需的植株丙（aabb）。
（1）花粉母细胞减数分裂时，联会形成的经染色体分离、姐妹染色单体分开，最终复制后的遗传物质被平均分配到四个花粉粒中。
（2）a基因是通过将T-DNA插入到A基因中获得的，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图1中选择的引物组合是。
图1
（3）就上述两对等位基因而言，F1中有种基因型的植株。
F2中表现型为花粉粒不分离的植株所占比例应为。
（4）杂交前，乙的1号染色体上整合了荧光蛋白基因C、R。
两代后，丙获得C、R基因（图2）。
带有C、R基因的花粉粒能分别呈现出蓝色、红色荧光。
图2
①丙获得了C、R基因是由于它的亲代中的在减数分裂形成配子时发生了染色体交换。
②丙的花粉母细胞进行减数分裂时，若染色体在C和R基因位点间只发生一次交换，则产生的四个花粉粒呈现出的颜色分别是。
③本实验选用b基因纯合突变体是因为：
利用花粉粒不分离的性状，便于判断染色体在C和R基因位点间，进而计算出交换频率。
通过比较丙和的交换频率，可确定A基因的功能。
答案（16分）
（1）四分体同源
（2）Ⅱ和 Ⅲ
（3）225%
（4）①父本和母本
②蓝色、红色、蓝和红叠加色、无色
③交换与否和交换次数乙
例题2．假设a、B为玉米的优良基因，现有AABB、aabb两个
品种，控制两对相对性状的基因位于两对同源染色体
上，实验小组用不同方法进行了实验（见右图），下列
说法不正确的是（）
A．过程①育种方法的原理是基因突变，最大优点是
能提高突变率，在短时间内获得更多的优良变异
类型
B．过程②③④育种方法的原理是基因重组，基因型
aaB_的类型经④后，子代中aaBB所占比例是5/6
C．过程⑤使用的试剂是秋水仙素，它可作用于正在分裂的细胞，抑制纺锤体的形成
D．过程⑥⑦应用了单倍体育种的方法，最大的优点是明显缩短
育种年限
答案B
例题3．（16分）紫杉醇是从红豆杉属植物中提取的最有效的抗癌制剂之。
目前，生产紫杉醇的主要原料是天然生长的红豆杉树皮，而大量剥取树皮会造成树木的死亡和资源的破坏。
请回答下列问题。
（1）为了合理开发和利用红豆杉，保护野生植物资源，科研人员取生长状况相似的野
生南方红豆杉和人上栽培的南方红豆杉，分别测量其不同部位完全烘干的样品中
紫杉醇的含量（占干重的百分比），测定结果见表l。
表1南方红豆杉树木各部位紫杉醇含量（％，
）
树皮
树叶
枝条
种子
野生植株
0.01777
0.00946
0.01280
0.01406
人工栽培植株
0.01483
0.00102
0.00193
0.01256
从实验结果看，红豆杉中紫杉醇含量最高的部位是，不同部位紫杉醇含
量不同的根本原因是。
为保护红豆杉资源，应以其为原料，提取、分离紫杉醇。
（2）科研人员为寻找更多紫杉醇来源，尝试利用植物组织培养技术，从红豆杉的愈
伤组织中提取紫杉醇。
实验结果如表2所示。
表2不同外植体形成的愈伤组织中紫杉醇含量（％，
）
实验组别
培养基中植物生长调节剂的组合与水平
外植体
树皮
树叶
顶端分生组织
1
2mg/L2,4-D
0.000
0.000
0.001
2
2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA
0.000
0.002
0.002
3
2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT
0.004
0.027
0.004
4
1.5mg/L2,4-D+0.5mg/LKT
0.000
0.012
0.009
5
0.5mg/L2,4-D+1mg/LNAA+0.5mg/LKT
0.000
0.027
0.004
①该实验的目的是研究。
②上述实验结果说明最适合做外植体，经过过程形成愈伤组织。
（3）2，4-D作为植物生长调节剂，在生产实践中还可以应用在等方面（写出两点即
可）。
答案．（除特殊标记外，每空2分，共16分）
（1）树皮基因的选择性表达树叶（枝条、种子）
（2）（4分）
①研究植物不同部位做外植体所形成的愈伤组织中紫杉醇的含量（2分）
研究不同生长调节剂的组合与水平对愈伤组织中紫杉醇含量的影响（2分）
②树叶脱分化
（3）（写出两点即可）。
除草剂，促进生长、促进扦插生根，培育无子果实或促进果实发育等
例题4.下图表示利用棉花叶肉细胞原生质体培养进行遗传改良的过程，据图分析不正确的是
A.①过程需在适宜条件下用纤维素酶和果胶酶处理
B.②过程能定向诱导原生质体产生优良性状的突变
C.③过程中叶肉细胞失去了其特有的结构和功能
D.④过程需用适宜浓度的生长素和细胞分裂素处理
答案.B
例题5.（12分）剪秋萝是一种观赏价值和药用价值都很高的花卉植物，为大量繁殖该植物，某校研究性学习小组对剪秋萝的组织培养进行了相关的探究。
（1）植物组织培养常用MS培养基，该培养基中的蔗糖能为离体组织细胞提供和
能源，同时能够维持细胞的。
与微生物培养基的营养成分相比，诱导愈伤组织的培养
基除了添加的糖类不同外，还应该。
（2）无菌技术是植物组织培养的关键，一般使用法对培养基进行灭菌；外植体消
毒一般采用70%的酒精和溶液处理，但处理既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植
物的耐受能力，若要探究对外植体消毒的最佳处理时间，实验的因变量应该是外植体的
和。
（3）研究小组若要利用三种不同浓度的6-BA（细胞分裂素类似物）溶液、三种不同浓
度的NAA（生长素类似物）溶液来研究两者用量的比例对诱导丛芽的影响，理论上应设计
组实验。
为了继续诱导生根，研究小组对诱导丛芽的最佳激素用量比例作了调整，他
们提高了6-BA的浓度而不改变NAA的浓度，然后将重新配制的两种植物生长调节剂溶
液直接加入诱导丛芽的培养基中继续培养，但指导老师告诉他们诱导生根的措施有明显错
误，请你帮助他们改正：
____。
【答案】
例题6.（15分）植物组织培养是克隆植物的一种方法，请回答相应的问题：
⑴培养皿中的培养基除添加外，还需要添加植物激素，其目的是
。
⑵培养过程需要植物的最适条件，否则在光学显微镜下可能观察到，进而使植物出现遗传不稳定甚至不育。
⑶在植物组织培养过程中，愈伤组织的成功诱导是至关重要的步骤。
科学家研究了植物生长调节剂对某药用植物愈伤组织诱导的影响，实验结果如下表：
培养基代号
2,4-D/mg·L-1
6-BA/mg·L-1
愈伤组织诱导率/%
L1
1.0
0
65.41
L2
2.0
0
68.76
L3
3.0
0
91.01
L4
3.0
0.2
54.48
L5
3.0
0.5
57.35
L6
3.0
1.0
51.71
注：
愈伤组织诱导率（%）=产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%
①从上表可以知道，在基本培养基中添加较高浓度的有利于形成愈伤组织，而添加则不利于愈伤组织的形成。
②在上述研究的基础上，为了探究光照对愈伤组织形成的影响：
应将已经消毒过的外植体平均分为甲、乙两组，分别接种到（填培养基编号）培养基上；甲组置于有光环境，乙组置于环境，其它条件相同且适宜；培养一段时间后，分别计数甲、乙两组中愈伤组织的并计算。
【答案】
⑴营养物质诱导外植体进行脱分化和再分化
⑵生长和繁殖发生染色体（结构与数目）异常
⑶①2,4-D6-BA②L3黑暗个数愈伤组织诱导率
【解析】⑴植物组织培养培养基中应添加各种必需营养物质，还需要添加植物激素如生长素、细胞分裂素，主要是为了诱导外植体进行脱分化和再分化。
⑵如果在培养过程中，条件不适宜植物可能发生变异，如基因突变、染色体变异，其中在光学显微镜下可能观察到的变异类型是染色体结构与数目异常。
⑶①据表格分析：
当仅加入2，4－D植物调节剂，且浓度由1.0mg/l逐渐增加到为3.0mg/l时，有利于愈伤组织的形成，若在此基础上再添加6－BA，就不利于愈伤组织的形成。
②据题干信息“探究光照对愈伤组织形成的影响”推知：
该实验的自变量是有无光照，因变量是愈伤组织诱导形成的几率，那么培养基等就是无关变量，在处理时无关变量时要做到相同且最适宜，因此在该实验中要把相应的材料放在最有利于愈伤组织形成的L3培养基中培养，两组给予自变量的处理：
甲组置于有光环境，乙组置于黑暗环境，两组放在无关变量相同且适宜等条件下处理一段时间，计数甲、乙两组中愈伤组织的个数，并计算愈伤组织诱导率。
例题7．（18分）优质彩棉是通过多次杂交获得的品种，其自交后代常出现色彩、纤维长短等性状遗传不稳定的问题。
请分析回答：
（1）欲解决彩棉性状遗传不稳定的问题，理论上可直接培养，通过育种方式，快速获得纯合子。
但此技术在彩棉育种中尚未成功。
（2）为获得能稳定遗传的优质彩棉品种，研究人员以白色棉品种57-4做母本，棕色彩棉做父本杂交，受粉后存在着精子与卵细胞不融合但母本仍可产生种子的现象。
这样的种子萌发后，会出现少量的父本单倍体植株、母本单倍体植株及由父本和母本单倍体细胞组成的嵌合体植株。
①欲获得纯合子彩棉，应选择植株，用秋水仙素处理植株，使其体细胞染色体数目加倍。
②下图是研究人员在诱导染色体数目加倍时的实验处理和结果，本实验的目的是探究，实验效果最好的实验处理是。
③欲鉴定枝条中染色体数目是否已加倍，可以通过直接测量，并与单倍体枝条进行比较作出判断。
欲检测染色体数目已加倍的植株是否为纯合体，在实践中应采用的方法，依据后代是否出现作出判断。
答案．（18分，除标记外，每空2分）
（1）彩棉花粉（花药）单倍体
（2）①父本单倍体芽（茎的生长点）
②不同秋水仙素浓度和不同处理时间对细胞内染色体数目加倍效果的影响
（此空共2分，每个要点1分）
0.05%秋水仙素，处理12小时（此空共2分，每个要点1分）
③茎的粗细、叶面积的大小（营养器官的大小）
（连续）自交性状分离
例题8．（22分）口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。
疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。
科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。
请据图回答。
（1）口蹄疫病毒的VP1蛋白进入动物体内，能引起机体产生特异性免疫应答。
VP1蛋白在免疫反应中称为。
（2）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，要获得VP1基因可用的方法合成DNA，再用将VP1基因片段切下。
（3）过程⑥的培养基中除了加入各种必需营养物质和等激素外，还需要添加筛选出含有重组质粒的叶片小段。
（4）获得表达VP1蛋白的番茄植株以后，需要进行免疫效力的测定。
具体方法是：
将转基因番茄叶片提取液注射到豚鼠体内，每半个月注射一次，三次后检测豚鼠血液内产生的的数量。
为了使结果可信，应设两组对照，分别注射和。
（5）口蹄疫疫苗注射到豚鼠体内后，首先由进行处理和呈递，最终激活B细胞，使其大量增殖分化成和，前者分泌大量抗体，后者在豚鼠再次受到感染时发生免疫应答。
答案．（22分）
（1）抗原
（2）逆转录限制性核酸内切酶
（3）生长素和细胞分裂素卡那霉素
（4）特异性抗体未转基因的番茄叶片提取液弱毒疫苗
（5）巨噬细胞浆细胞（效应B细胞）记忆B细胞
诱导性多能干细胞
在动物细胞中目前是不能做到脱分化的。
植物的脱分化是可以做到的，主要表现在愈伤组织的生成。
这可能与外植体激素水平的变化有关，从而导致分裂出的细胞表现为薄壁的分生组织的性质。
植物细胞可长期分裂增值可能是由于其端粒酶活性较高的缘故。
端粒酶可修复每次细胞分裂造成的染色体端粒缩短。
植物细胞一般认为可无限分裂。
诱导多能干细胞inducedpluripotentstemcellsiPS：
2006年日本京都大学ShinyaYamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
例题1．下图表示科学家利用小鼠的纤维母细胞培养体系培养多种细胞的过程，下
列叙述正确的是
A．与纤维母细胞相比，经过程①形成的诱导性干细胞的全能性较低
B．过程②的结果说明，诱导性干细胞中遗传信息的表达情况不同
C．诱导性干细胞与上皮细胞在功能上有差异，形态上没有差异
D．上述细胞中具有细胞周期的是诱导性干细胞和神经细胞
答案B
例题2.科学家把从小鼠胚胎干细胞中分离获得的4个基因通过病毒导入已分化的小鼠成熟细胞，发现成熟细胞返回到了未成熟的干细胞状态。
这种干细胞（iPS细胞）又能在不同条件下分化形成神经细胞等多种细胞。
下列叙述不正确的是
A.此实验过程中病毒发挥了载体的功能
B.此实验过程中运用了动物细胞培养技术
C.分化形成的神经细胞能进行遗传信息的表达
D.iPS细胞分化形成的多种细胞所含核基因不同
答案D
T-DNA
T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构。
另外，T-DNA也叫transferredDNA。
是Ti质粒上的片断，T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱。
T-DNA技术是构建突变体库，反向遗传学的突破性技术之一。
T-DNA是农杆菌Ti（tumorinducing）或Ri（rootinducing）质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。
农杆菌Ti（tumorinducing）或Ri（rootinducing）质粒已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。
T-DNA是Ti质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（主要是双子叶植物）时分别诱发根瘤，opine化合物的合成和抑制细胞分化。
Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体，而外基因就是整合到T-DNA上的。
一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或病毒来充任，而在众多的载体中目前仅有Ti质粒在转化植物受体方面取得较多的成功。
所以Ti质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统。
农杆菌侵染植物后，Ti质粒中的T-DNA区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体上。
因此，如果把外源基因插入T-DNA中，就有可能携带进入受体植物并整合到染色体上。
例题1（16分）T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。
用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：
种植野生型拟南芥，待植株形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。
在适宜条件下培养，收获种子（称为T1代）。
（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除，因为后者产生的________会抑制侧芽的生长。
（2）为筛选出已转化的个体，需将T1代播种在含的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T2代）。
（3）为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T2代播种在含的培养基上，获得所需个体。
（4）经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体。
为确定抗盐性状是否由单基因突变引起，需将该突变体与植株进行杂交，再自交代后统计性状分离比。
（5）
若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性。
（6）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。
其过程是：
提取植株的DNA，用限制酶处理后，再用将获得的DNA片段连接成环（如右图），以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片断中选取作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。
【答案】
（1）顶芽生长素
（2）（一定浓度的）除草剂
（3）（一定浓度的）盐
（4）野生型1
（5）降低
（6）突变体DNA连接酶B、C
例题2（18分）
为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d。
现以野生植株和突变植株作为亲本进行杂交实验，统计母本植株的结实率，结果如下表所示。
杂交编号
亲本组合
结实数/授粉的小花数
结实率
①
♀DD×♂dd
16/158
10％
②
♀dd×♂DD
77/154
50％
③
♀DD×♂DD
71/141
50％
（1）表中数据表明，D基因失活使________配子育性降低。
为确定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可将________作为目的基因，与载体连接后，导入到________（填“野生”或“突变”）植株的幼芽经过________形成的愈伤组织中，最后观察转基因水稻配子育性是否得到恢复。
（2）用________观察并比较野生植株和突变植株的配子形成，发现D基因失活不影响二者的________分裂。
（3）进一步研究表明，配子育性降低是因为D基因失活直接导致配子本身受精能力下降。
若让杂交①的F1给杂交②的F1授粉，预期结实率为________，所获得的F2植株的基因型及比例为________。
（4）为验证F2植株基因型及比例，研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如下图所示：
随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。
若________，则相应植株的基因型为Dd；同理可判断其他基因型，进而统计各基因型比例。
（5）研究表明D基因表达产物（D蛋白）含有WD40（氨基酸序列），而通常含有WD40的蛋白都定位在细胞核内。
为探究D蛋白是否为核蛋白，研究者将D基因与黄色荧光蛋白基因融合；同时将已知的核蛋白基因与蓝色荧光蛋白基因融合。
再将两种融合基因导入植物原生质体表达系统，如果________，则表明D蛋白是核蛋白。
答案（除注明外，每空2分，共18分）
（1）雄D基因突变脱分化（或“去分化”）
（2）显微镜（1分）减数（1分）
（3）30％DD:
Dd:
dd=5:
6:
1
（4）两种引物组合均可完成扩增
（5）两种荧光的定位（模式）相同（或“两种荧光同时出现在细胞核中”）
例题3.（20分）烟草是种植广泛的经济作物，由于相关病毒的感染会导致大量减产。
烟草花叶病毒（TMV）和车前草病毒（HRV）主要由蛋白
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