医学遗传学实验讲义.docx
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医学遗传学实验讲义
医学遗传学实验讲义
浙江大学医学院
医学遗传学课程组
2012年9月3日
实验一人类外周血染色体标本制备
一、实验目的
通过实验了解和掌握人类外周血染色体标本培养和制备的基本方法。
二、实验原理
正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。
1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）或其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。
这样经过短期培养（colchicine），秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
三、实验准备
实验材料
人外周血（淋巴细胞）
实验器具
离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头（61/2号）、吸管、量筒、火柴、酒精灯、pH计、研钵、饭盒、超净工作台、镊子、载玻片、玻片盒、烧杯、染缸、试管架、玻璃铅笔或记号笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。
药品和试剂
1．培养液的配制
RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠）80%
小牛血清（56℃水浴灭活30分钟，灭活可破坏补体及一些污染的病毒）20%
植物血凝素PHA（主要成分是粘多糖和蛋白质,可用培养基溶解）4%
青霉素终浓度 100U/ml
链霉素终浓度 100U/ml
用3.5%NaHCO3调pH7.0～7.2，用玻璃滤器，抽滤灭菌。
在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5ml）。
培养液置于-20℃冰箱保存。
使用前从冰箱中取出，温育至37℃。
2．肝素
浓度为0.2%，作为抗凝剂使用。
200mg肝素粉末溶于100ml生理盐水中。
高压灭菌，-4℃冰箱保存备用。
3．KCl
浓度为0.075M，0.559g氯化钾溶于100ml双蒸水中。
氯化钾作为低渗液的优点是染色体轮廓清楚，可染性增强，时间缩短。
4．秋水仙素
10g/ml，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。
称取10mg秋水仙素溶于100ml生理盐水中，配成100g/ml的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存备用。
临用时取上述原液用生理盐水稀释成10g/ml。
5．甲醇
6．冰醋酸
7．吉姆沙（Giemsa）染液
吉姆沙原液：
先将0.5g吉姆沙粉末干研磨，时间越长越好；加33ml60℃预热的纯甘油，在研钵中研磨，放在60℃恒温水浴中保温90分钟。
冷却后，再加入33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存，作为原液。
原液要提前半年配制。
原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。
1份Giemsa原液＋9份磷酸缓冲液
8．磷酸缓冲液（pH6.8）
溶液A：
磷酸二氢钾（KH2PO4.2H2O）9.078g溶于1000ml蒸馏水中。
溶液B：
磷酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O）11.876g溶于1000ml蒸馏水中。
100ml缓冲液：
需溶液A50.8ml，溶液B49.2ml。
四、实验步骤
1．采血
先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取2ml干燥灭菌注射器，配上针头（61/2号）并吸取肝素液0.2ml湿润针筒，采静脉血2ml，转动针筒使血与肝素混匀。
2．培养
采血完毕立即将针头插入含RPMI1640培养瓶内（瓶盖预先用酒精棉球消毒），每瓶滴入30滴血，摇匀。
2ml血可分装三至四瓶。
置37℃0.5℃恒温中培养72小时，其间可摇动2~3次。
3．秋水仙素（colchicine）处理
在终止培养前2~3小时，加入秋水仙素，61/2号针头3滴（每ml约60滴），使细胞分裂终止在中期。
秋水仙素的浓度不宜过高和作用时间过长，虽然这样做可以得到较多的分裂相，但导致染色体过分缩短，不宜用于显带分析。
4．离心
将培养物倒入刻度离心管内，以1000rpm离心10分钟，弃去上清液，留底层沉淀物并
用吸管打匀。
5．低渗处理
加8ml预温（37℃）的0.075MKCl低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水
浴箱静止25~30分钟，使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。
低渗处理的效果与低渗的成分、处理的时间和温度有关。
这是比较关键的一步，对任一组织和低渗液都要事先进行预实验，以确定最合适的处理时间。
6．预固定
在低渗25~30分钟后，加新配置的固定剂（甲醇:
冰醋酸，3:
1）1ml，打匀。
这样有助于细胞的均匀悬浮而不团聚凝块和防止细胞丢失。
甲醇和冰醋酸要现配现用，如放置时间较长，即不宜再用，以免影响固定效果。
7．再离心
1000rpm离心10分钟，弃去上清液，留沉淀物。
8．固定
沿离心管壁加入新配制的固定液（甲醇:
冰醋酸，3:
1）至5ml，将沉淀物打匀，固定15~25
分钟。
9．再离心
1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
10．再固定：
加入新配制的固定液（甲醇:
冰醋酸，1:
3）至5ml打匀，固定15~25分钟。
11．再离心
1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
12．再固定
加入新配制的固定液（甲醇:
冰醋酸，1:
1）至5ml打匀，固定15~25分钟，或冰箱中
放置数小时，也可以过夜。
13．制片
经上述固定后，1000rpm离心留下约0.3ml沉淀物，打匀。
用吸管吸取细胞悬液，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在酒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（或用电吹风吹干）。
14．染色
用Giemsa染液染色8分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。
15．镜检
将染色后的玻片先用低倍镜全面检查，找到良好的分裂相，换用高倍镜、油镜观察分析。
五、注意事项
1．在采血接种培养时，注意不要加入太多的肝素。
肝素过多时可能引起溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂；但肝素也不能过少，以免发生凝血现象。
2．培养基中不含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，则溶解有RPMI1640培养基的液体可先用浓盐酸调pH4.0，然后高压灭菌（注意121℃，0.15MPa，灭菌15分钟）。
冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA、灭活小牛血清和双抗，再调pH7.0，分装备用。
L-谷氨酰胺和碳酸氢钠用微孔滤膜过滤灭菌，不能高压灭菌。
3．接种的血样愈新鲜愈好，最好在24小时内培养。
如果不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。
4．温度和培养液的酸碱度十分重要。
人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为37℃0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。
培养液的最适pH7.2~7.4，偏酸，细胞发育不良；偏碱，细胞会出现轻度固缩。
5．PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。
PHA如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。
6．培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。
7．最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。
8．培养失败的可能原因
（1）培养瓶等器材洗涤不合要求。
（2）配制培养液使用的二或三蒸水不合要求。
（3）PHA和培养基存放时间过长。
（4）无菌操作不符合要求，发生细菌污染。
9．标本质量不佳的原因
（1）秋水仙素处理不当。
秋水仙素的浓度、处理时间不够，结果分裂相少；如果秋
水仙素的浓度过高、处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行分析。
工作时，需要摸索处理时间和浓度。
（2）低渗处理不当。
低渗时间过长时，细胞膜往往过早破裂，导致分裂细胞丢失或
染色体丢失；低渗处理时间不足时，细胞膨胀不够，染色体分散不佳，难以进行染色体计数和分析。
低渗时间的掌握与气温有关。
（3）离心速度不合适。
如果从培养瓶收集细胞进行离心时的速度太低，细胞丢失；
如低渗后离心速度过高，则往往分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相多被丢失。
（4）固定不充分。
如固定液不新鲜，染色体形象模糊，呈毛刷状，染色体周围有胞
浆背景。
因此，固定液纯度要高，临用时新鲜配制。
六、作业
选择观察10个较好的细胞分裂相，计数染色体数目。
附染色体培养实验器材的准备
细胞培养和染色体制片过程中所用的培养瓶等玻璃器材和橡皮塞等在使用前，都要经过严格的洗刷、浸泡、蒸馏水洗和灭菌等过程，以保证清洁无菌。
一、器材的清洗
1．清洗液的配制
重铬酸钾120g
浓硫酸160ml
蒸馏水 1000ml
先将重铬酸钾倒入蒸馏水中，然后慢慢加入浓硫酸，边加入边用玻璃棒搅拌。
由于加入浓硫酸时会产生高温，所以不能用玻璃容器，而可用塑料桶或陶瓷缸。
配制好的清洁液，应储存在有盖的容器内。
如清洁液已呈绿黑色时，表明已经失效，不能再用。
硫酸的腐蚀性强，操作时要戴防护手套，不能用金属镊子去夹玻璃瓶等。
2．一般玻璃器皿的处理
玻璃器皿先用自来水洗去赃物，用肥皂液煮沸30分钟后，趁热刷洗干净，用自来水冲洗去掉肥皂残迹，空气干燥。
放入清洁液中浸泡1天，然后取出，自来水充分冲洗，在蒸馏水中浸泡一天，再换一次蒸馏水，浸泡一天。
置80℃烤箱中烘干。
用牛皮纸包扎瓶口，干热灭菌150℃2小时。
3．玻璃细菌滤器的处理
新购滤器用自来水刷洗后，装上新配洗涤液（化学纯浓硫酸6ml，化学纯硝酸钠2g，蒸馏水100ml），让其自然滤过，然后用自来水、蒸馏水反复滤过，接着用1M的NaOH溶液过滤至液体呈中性。
空气干燥，用牛皮纸或玻璃纸包好，高压灭菌。
用过的滤器必须立即进行清洗，先在清洁液中浸泡一天，然后自来水冲洗，蒸馏水浸泡一天，蒸馏水抽滤多次，使堵塞滤孔的物质完全除去。
4．橡胶类制品的处理
新橡胶类制品用水刷洗后，用2%的NaOH溶液煮沸20分钟，然后用自来水冲洗，用2%的HCl溶液煮沸20分钟，自来水洗，蒸馏水中浸泡24小时，晾干，牛皮纸包扎，高压灭菌。
用过的橡胶类制品立即泡于清水中，用肥皂液刷洗后，用自来水冲洗，蒸馏水中浸泡24小时，晾干，牛皮纸或玻璃纸包扎，高压灭菌。
5．载玻片的处理
将载玻片一片一片放入肥皂溶液煮沸20分钟，刷洗干净后，用自来水冲洗，蒸馏水中浸泡24小时，放入装有蒸馏水的饭盒中，置冰箱中冷冻待用。
二、灭菌
1．干热灭菌（dryheatsterilization）
一般采用电热鼓风干燥箱进行干热灭菌。
一般玻璃和金属器材都可使用干热灭菌，较为方便。
布类、橡皮类、液体不能用干热灭菌。
灭菌时的温度和时间是：
150℃干烤2小时。
必须注意以下事项：
（1）放置入烤箱的物品，要间隔一定距离，以免影响灭菌效果。
特别不要将包扎纸
直接与烤箱箱壁或箱底接触，以免在高温下烤焦、起火。
（2）烤箱电源打开后，门上应挂一个标示牌，以免他人误开箱门，使冷空气突然进
入烤箱，造成玻璃器皿破裂。
（3）先加热至80℃左右，使箱内空气完全排空后，再关闭气门，150℃烤2小时后
自然冷却。
（4）干热灭菌过程中，应有专人负责照看。
2．高压灭菌（autoclavingsterilization）
一般用手提式电热高压蒸汽灭菌锅，既经济又省时，效果也好，是实验室经常采用的方法。
一般玻璃器材、玻璃滤器、橡胶类制品、布类和一些溶液都可用高压灭菌。
灭菌时不要装的太满，液体不要装瓶过满，瓶塞上插上一个注射针头，以免高压过程中容器炸裂或瓶塞掉出。
拧紧锅盖后，打开电源，打开排气孔，待升温至排气孔排出气流呈直线，冷空气已基本排出时，关上排气孔。
直至气压达0.15MPa后，继续灭菌20分钟。
灭菌完毕后，关上电源，待压力自然下降，温度降低后再打开锅盖，取出物品。
趁热放入80℃烘箱内烘干待用。
3．过滤除菌（filtersterilization）
细胞培养中的常用的生物性物质，如培养液、血清、酶溶液等不能用高热或高压灭菌，只能用过滤法除菌。
此外，NaHCO3等类物质遇高热时会发生分解，故需要用过滤法除菌。
（1）玻璃滤器
有六个型号，其中G6型滤器可以有效的除菌。
玻璃滤器在高压灭菌之后，
板上将析出少量碱性物质，所以，用它过滤后，液体的pH值将会有所增高，因此，在调配液体时应考虑这一情况。
用玻璃滤器抽滤时，抽滤不要过快，以滤液分滴滤下较为合适。
注意避免液体抽干后仍在继续抽滤。
（2）微孔滤器
滤膜常用醋酸纤维薄膜，具有灵敏度高、方便、经济省时的优点。
滤器的后方接一个5ml的注射器。
滤膜可以耐高压灭菌，0.2m孔径的内膜的除菌效果即与G6型玻璃滤器相当。
实验二人类染色体核型分析
一、实验目的
通过实验掌握染色体核型分析的常用方法以及G带的带型特征和识别技巧，初步学会识别G带染色体。
二、实验原理
将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像就称之为该细胞的核型（karyotype），这通常是用显微摄影得到的染色体相片剪贴而成（目前可通过相关软件在电脑中自动排列）。
在显带技术问世以前，人们主要根据染色体的大小、着丝粒的位置，将人类染色体顺次由1编到22号，并分为七组。
但要想精确、有把握地鉴别每条染色体是比较困难的。
70年代初出现了染色体显带技术，不仅解决了染色体识别困难的问题，而且为深入研究染色体异常及基因定位创造了条件。
将染色体标本用显带方法处理后，再用Giemsa染色，这类技术就称为G分带，通过显微摄影，就可得到G带染色体的显微相片。
三、实验准备
实验材料：
显微相片1份2张。
实验器材：
镊子、剪刀、胶水、实验报告纸。
四、实验步骤
1．先贴一张相片于报告纸上方。
2．将另一相片上的染色体逐个剪下，按丹佛和人类染色体遗传学命名的国际体制（ISCN）排列编号。
粘贴时短臂向上，长臂向下。
3．在分析结果中，写出该细胞的核型式，注明性染色体。
五、作业
剪贴正常男性或女性染色体显微相片一张。
附人类染色体G分带特征描述
1号染色体
最突出的特征是在长臂近着丝粒处有一块浓染的块状物质。
长臂有5条深带，
中央一条最宽最深。
短臂近着丝粒端1/2处有2条宽阔的深带，远端有3～4条较窄的淡带。
2号染色体
与1号染色体相比为亚中着丝粒并缺乏明显的界标。
长臂有4～5条分布均
匀的深带，中央2个常融合为1个带。
3号染色体
中央着丝粒染色体，带型近乎对称。
两臂的近端和远端染色甚深，而中心部位染色较浅。
4号染色体
与5染色体相比着色均匀。
长臂上有4～5条很均匀的深带，短臂中央有1~2条深带。
5号染色体
长臂中部有一宽的中央带，远端有2个深带。
短臂可见1～2条深带，远端的深带宽且
色浓。
6号染色体
长臂有4条均匀的带，短臂中部有一明显而宽阔的浅带，其近、远端各有一深带，近端
深带紧贴着丝粒。
7号染色体
长臂有3条带，远端一条较浅。
短臂上有3条深带，远端一条较宽且色深，有如“瓶盖”。
8号染色体
长臂中部有一宽带，短臂有2条分布均匀的深带，中部有一较明显的浅带。
9号染色体
长臂有2条均匀隔开的明显深带，短臂有特别的心形外貌，近端和中部各有一深带。
10号染色体
长臂有3条明显的深带，其中近端一条带最深，短臂近端和近中部有一宽带。
11号染色体
长臂紧贴着丝粒有一深带，远端可见一明显的较宽的深带，这条深带与近端的深带之间
的1条宽阔的浅带。
短臂近中部有一深带。
12号染色体
长臂紧贴着丝粒有一深带，中部有一宽的深带，这条深带与近端深带之间有一明显浅带。
但与11号染色体比较，这条浅带较窄，是区别11、12号染色体的主要特征。
13号染色体
长臂可见4条深带。
14号染色体
长臂近端有一深带，其远端也有一明显的深带。
15号染色体
长臂近中部有一明显的深带，远端着色浅，有时可见2条浅带。
16号染色体
长臂中和远端各有一深带，有时远端不明显。
短臂染色浅，可有1～2条带。
17号染色体
长臂远端有一深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。
短臂上的一条窄带紧贴
着丝粒。
18号染色体
长臂有2条宽带，近端一条较远端的宽些，短臂上有一窄带。
19号染色体
着丝粒及周围为深带，其余均为浅带。
20号染色体
两臂的远端着色，短臂着色较长臂深些。
21号染色体
长臂近端有一宽阔深带，远端浅染。
22号染色体
长臂上有2条深带，近端的一条着色深，紧贴着丝粒。
近中部的一条着色浅，有时不显现。
X染色体
长臂可见4～5条深带，近中央有一与短臂相似的深带，似“竹节”状。
短臂中部有明
显中央深带。
Y染色体
长臂有2条远端带，有时整个长臂被染成深带。
带型识别口诀
一秃二蛇三蝶飘四象鞭炮五黑腰六号1、4小白脸
七上八下九苗条十号q肩带好十一低来十二高
十三、十四、十五号（3.2.1）十六q缢痕大十七q带脚镣
十八人小大肚泡十九是黑腰二十头重脚底浅
二十一象个葫芦瓢二十二头小，身子大X扁担，两头挑
人类染色体核型分析实验报告
班级------------
姓名------------
标本编号：
分析结果：
12345
—————A———————B———
6789101112
————————————C—————————————
1314151617181920
————D——————E——————F—
2122
—G—性染色体
实验三人类染色体G带标本制备及观察
一、实验目的
通过实验掌握G带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G带分裂相。
二、实验原理
有许多显示G带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。
通过胰酶处理使G带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态，由此可见在G带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。
Giemsa染料是由天青和伊红组成的，染色首先取决于二个天青分子同DNA结合，在此基础上结合一个伊红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。
关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。
三、实验准备
实验材料
常规的人类体外周血染色体制片。
实验器材
恒温水浴箱、烧杯、染缸、显微镜附油镜头、香柏油、擦镜纸、恒温培养箱、镊子、记号笔或铅笔等。
药品和试剂
1．Hanks液
NaCI2.0g
KCI0.1g
Na2HPO4.12H2O0.0375g
K2HPO40.015g
葡萄糖0.25g
加双蒸水250ml及1%酚红0.5ml，成Hanks液。
2．胰酶液
称取胰酶0.2g溶于100mlHanks液中，搅拌半小时，用1NNaOH调pH7.0～7.2，冷
冻保存。
（最好现配现用）
3．磷酸缓冲液（pH6.8）
4．Giemsa染液
5．生理盐水
四、实验步骤
1．先将胰酶液水浴加热到37℃。
2．将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不等，依样本存放时间长短而定。
（标本需预先经60～70℃烤2小时，或37℃恒温老化5～7天。
标本太新鲜，染色体有些毛）
3．取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗。
4．Giemsa染液染色8分钟。
5．自来水洗、晾干。
6．镜检。
选择分散及显带良好的分裂相，在油镜下观察。
如观察到染色体变粗并显得
毛糙边缘，有时甚至呈糊状，是处理过度了。
观察细胞的标准：
（1）细胞完整，轮廓清晰，染色体在同一平面上均匀分布。
（2）染色体形态和分散良好，最好无重叠现象，即使染色体个别重叠，也要能明显
辨别。
（3）所观察的染色体长短大致一样，处于同一有丝分裂时期。
（4）在所观察的染色体周围没有多个或单个散在的染色体。
五、注意事项
1．带效果的好坏，主要决定于染色体的标本质量。
标本染色体要长，染色体分散合适，
背景无胞浆，标本未老化即保存时间过长。
2．要注意胰酶处理的温度和时间，稳定显带的条件，才能保证显带效果。
3．磷酸缓冲液的pH值不要过碱，偏酸为宜，否则着色不鲜明。
4．G带制备有许多种方法，各个实验室在细节处理上均不同，最好总结出适合自己实
验室采用的方法。
如果使用效果良好，不要轻易更换新方法。
六、作业
画出显微镜下你所观察的分裂相，要求标明染色体号数，请实验指导老师复核。
实验四Duchenne型肌营养不良症（DMD）基因检测
一、实验目的
掌握Duchenne型肌营养不良症基因（DMD）检测的简便方法。
二、实验原理
1985年，KaryMullis创建了聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）技术，简称PCR技术。
PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等特点。
PCR反应是由变性（denaturation）、模板与引物结合（复性annealing）及延伸（extension）三个步骤为一个周期的不断重复过程，经过25～30次循环之后，理论上可扩增109倍。
PCR反应中通常只有一对寡核苷酸引物，而多重PCR（multiplexPCR）则是用几对引物在同一个PCR反应体系中进行扩增，这样可以同时扩增出几个不同专一靶区域的片段。
Duchenne型肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy，DMD）是一原发于肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力，临床表现腿的假性肥大，血清酶学明显升高。
本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。
DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，全长2300kb左右，由79个外显子组成，编码含3685个氨基酸的蛋白质－抗肌营养不良蛋白（dystrophin），这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。
DMD基因有多种突变形式，60%是外显子缺失突变，5%是重复突变，35%可能是很小的DNA片段缺失或点突变。
通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。
为节省经费，本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。
DMD基因4个外显子的引物顺序
外显子PCR产物大小引物F引物R
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三、实验准备
实验材料
正常对照DNA样本、DMD患者DNA样本。
基因组DNA稀释至100ng/l，备用。
实验器材
微量加样器
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