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PCR引物设计技巧

PCR引物设计知识与技巧分析

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309发布时间：

2010-7-19

PCR引物设计知识与技巧分析

自从1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（PCP）以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。

然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。

现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。

1引物的设计以及初步筛选

引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件PrimerPremier5或美国whitehead生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序Primer3来设计引物，再用软件Oligo6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。

但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。

因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。

所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。

下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。

①引物的长度一般为15-30bp，最好在18~24bp，因为太短易形成错配（Falsepriming）降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量。

②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。

特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

③引物序列的GC含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。

④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0keafmol。

⑤避免形成稳定的引物二聚体（DimerandCrossDimeO和发夹结构（Hairpin），AG高于4．5keal／mol时易引发上述两种结构的产生。

⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600bp比较理想。

而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300bp比较理想。

⑧5’端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物。

只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。

常用到的引物设计软件有PrimerPremier5和Oligo6、primer3。

2引物的二次筛选

引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。

本步应注意以下两点：

一是得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。

也就是把每条引物在比对工具（http:

//www.NCBI.nlm.nih.gov/Blast/）的blastn中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。

一般连续10bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6bp的同源。

二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点（例如http:

//CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。

3引物的最终评估

当我们经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCR扩增可以对引物进行最终的评估。

一是PCR扩增的特异性和效率。

经过PCR条件优化后能否获得特异性条带，即无目的条带之外的多余条带。

另外，PCR产物的量是否足够，即无不出带和条带很弱的现象。

二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。

如果相差太大G于100b，有可能是错配产物。

三是是否形成引物二聚体带。

我们结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出鉴定，为我们以后进行引物设计积累宝贵经验。

4用比较基因组学分离新基因时引物设计的注意事项

扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满足要求，但是当运用比较基因组学分离新基因时，设计引物还应注意以下两点：

①模板的选择。

如果以DNA为模板设计引物

首先在Genebank中找到与待分离新基因同源的其它物种的该基因。

利用http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的Blast工具和http:

//www.ebi.ac.uk/elustalw/的ClustalW工具把已检索到的基因进行同源性比较，根据比

较基因组定位的原理，选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物（如小鼠）保守功能基因DNA序列设计引物，该引物区段要求在各物种间绝对保守，差异不要大于2bp，特别是3’端必须完全同源。

如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新基因的EST一重叠群为模板设计引物，要求ESTs与信息探针之间同源性大于80％，长度大于100bp，并且避免在EST的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。

②引物序列最好位于相临的外显子区且至少距离外显子与内含子剪接处25bD以上，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

PCR引物设计的11条黄金法则

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。

应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。

引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：

加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。

在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：

1）避免重复碱基，尤其是G.

2）Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.

4）3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6）PCR扩增产物长度：

引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

7）引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。

对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

引物合成介绍

（1）

1.引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

  第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

  第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

　第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

  第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？

◆　C18柱脱盐：

有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

它不能有效去除比目的片段短的小片段。

实际上，它是一种脱盐的作用。

这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。

对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆　OPC纯化：

 OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。

OPC法纯化的DNA纯度大于95%。

适用于40mer以下引物的纯化。

◆　PAGE纯：

PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链OligoDNA（大于50mer）的纯化特别有效。

◆　HPLC纯化：

HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。

纯度可以大于99%。

主要用于短链和修饰引物的纯化。

该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。

3.引物的OD数如何定量？

答：

引物合成引物OD数是这样测定的：

用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。

测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。

DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。

需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.投诉定量不准是怎么回事儿？

答：

我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有

（1）生产人员定量错误。

这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。

公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。

合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。

一般情况下，引物都有留样。

接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。

（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。

这种情况很少见。

（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。

使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。

（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。

这种情况比较常见。

（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

   例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：

 加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。

5.需要什么级别的引物？

答：

引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。

根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用       引物长度要求       纯度级别要求

一般PCR扩增      <45base OPC

      >45base PAGE

诊断PCR扩增      <40base OPC,PAGE

DNA测序      20base左右    OPC

亚克隆，点突变等       根据实验要求定    OPC,PAGE，HPLC

基因构建（全基因合成）    根据实验要求定    PAGE

反义核酸       根据实验要求定    PAGE

修饰引物       根据实验要求定    PAGE,HPLC 

6.最长可以合成多长的引物？

答：

引物越长，出现问题的概率就越大。

我们合成过120base的引物，但是产率很低。

除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。

7.需要合成多少OD数？

答：

根据实验目的确定。

一般PCR扩增，2OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1OD就足够了。

但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10OD。

做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。

片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。

超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

8.如何检测引物的纯度？

答：

实验室方便的作法是用PAGE方法。

使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃,2mins）。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

9.如何计算引物的浓度？

答：

引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

引物一般配制成10-50pmol/ul。

 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。

如果不一致，请和我们联系。

我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：

V（微升）=OD数*（乘）33*（乘）*（乘）20000/（除） 引物的分子量。

引物的分子量可以从合成报告单上获得。

如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：

1OD260=33ug/ml.

10.如何计算引物的Tm值？

答：

引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：

Tm= 4℃（G+C）+ 2℃（A+T）

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41（%GC）–600/size        

公式中，Size= 引物长度。

Tm的定义：

Tm=Temperatureatwhich50%ofagivenoligonucleotideishybridizedtoitscomplementarystrand.Intheabsenceofdestabilizingagents,likeformamideorurea,Tmwilldependon3majorparameters:

Thesequence:

aGC-richsequencehasahighermeltingtemperature.Thestrandconcentration:

higholigonucleotideconcentrationsfavorhybridformation,whichresultsinahighermeltingtemperature.  Thesaltconcentration:

highionicstrengthresultsinahigherTmascationsstabilizetheDNAduplexes.

11.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

答：

非修饰的引物的MolecularWeight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。

如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。

或按下列公式计算MW=（NA*WA）+（NC*WC）+（NG*WG）+（NT*WT）+（Nmod*Wmod） ＋（Nx*Wx）+（Ni*Wi）+16*Ns– 62.

NA,NG,NC,NT,Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WC,WG,W,Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2=321.21。

Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量

Base MolecularWeight

A     313.21

C     289.18

G     329.21

T     304.19

I      314.2

U     290.17

常规修饰基团分子量

5’-Biotin  405.45    3’-TAMARA   623.60

5’-（6FAM）     537.46    3’-Dabsyl       498.49

5’-HEX   744.13    3’-（6FAM）     569.46

5’-TET   675.24    3’-AminoModifierC3    153.07

5’-Cy5    533.63    3’-AminoModifierC7    209.18

5’-Cy3    507.59    3’-ThiolModifierC3      154.12

12.如何溶解引物？

答：

干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。

根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM TrispH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。

13.如何保存引物？

答：