培养细胞之死活细胞的鉴别实验报告.docx

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培养细胞之死活细胞的鉴别实验报告

生物化学实验报告

培养细胞之死活细胞的鉴别

一、实验目的

1.1学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

1.2了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。

1.3熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。

1.4学习细胞生死状态鉴别的方法。

1.5了解细胞生死状态鉴别的原理。

1.6熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。

1.7掌握细胞技术方法，计算细胞存活率

二、实验原理

细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术 

细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：

① 细胞膜通透性的差异：

活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。

基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。

此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。

活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。

② 代谢上的差异：

活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。

基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。

另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。

亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。

活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。

三、实验器材

3.1 器材：

解剖剪、解剖镊、培养皿、纱布块、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、L型注射器、离心管等。

上述器材需彻底洗净、烤干、包装好，灭菌，备用。

超净工作台、CO2培养箱、普通光学显微镜、离心机、血球计数板、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、解剖板、盖玻片等。

3.2试剂：

培养液、PBS液 0.4%台盼蓝染液

3.3材料：

小白鼠

四、操作步骤

4. 1取材 

取小白鼠一只，采用断头法处死：

清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。

取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。

取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。

转入无菌玻璃培养皿，待用。

 4.2 分离脾细胞 

4.2.1用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。

4.2.2用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。

4.2.3吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf发管，并使量至1ml，以3000r/分离1—2分钟。

4.3 培养脾细胞 

4.3.1超净工作台中取塑料培养皿一个，用移液枪（1000μl）加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。

4.3.2 取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用移液枪（200μl）吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

4.4 台盼蓝法鉴定细胞的生死状态：

4.4.1试剂配制：

用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。

4.4.2染色计数：

取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。

注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。

在普通光镜10倍物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。

4.4.3根据染色结果计算活细胞率：

依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：

细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数 *100%

4.5关于血球计数板 

4.5.1血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分割成两半，每个半边上面各有有一个方格网，每个方格网共分九大格，其中间的一大格（又称计数室）常被用作细胞的计数。

计数室的刻度有两种：

一种是大方格分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但是不管计数室是哪一种构造，他们都有一个共同特点，即每个大方格都有400个小方格组成。

图1血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）

图2血球计数板网格的分区和分格

每个大方格边长为1mm,则每一大方格的面积为1mm2,每个小方格的面积为1/400mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，所以每个小方格的体积为1/400mm3若取四个大方格的细胞数，则：

    每毫升液体中细胞的数=每个大方格中的细胞数量*10000*稀释倍数

4.5.2此次实验中，使用的是前一种血球计数板，因此分别选取左上、左下、右上、右下四个中方格进行计数。

五、注意事项

5.1在进行方格查数时注意：

数上不数下，数下不数上。

5.2 实验涉及的台盼蓝染料有致癌危险，因此滴加染液时要小心，防止溅到皮肤上。

5.3动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用，整个实验过程都要有无菌操作的概念，避免细胞被污染。

5.4在超净工作台内点燃酒精灯后，实验操作应在火焰的附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后要待其冷却才能夹取组织，经过培养液的用具不能长时间烧灼，以免烧焦形成碳膜。

5.5超净工作台内吸取溶液用的的各种吸管等不能混用，以免相互污染。

5.6在超净工作台中，组织细胞、培养液等不能敞开暴露过久，以免溶液蒸发和pH变化。

5.7 器皿、离心管培养瓶等在离开超净工作台前必须将盖子或橡皮塞盖紧，以防止细胞污染或溶液漏出。

六、实验结果

取样位置

左上

左下

右上

右下

活细胞数

27

33

35

37

死细胞数

78

61

89

80

细胞总数

105

94

124

117

每大格细胞总数平均值为110，每大格平均死亡细胞数为77

每毫升溶液中细胞总数=110*10000*2=2.2*106个

细胞存活率=（110-77）/110*100%=30.0%

七、分析与讨论

7.1实验数据讨论

此次实验，我组测得细胞存活率为30.0%，经过交流，有些组的细胞存活率达到44.6%，分析存活率相对较低的原因如下：

7.1.1无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会影响观察，导致实验失败； 

7.1.2在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡； 

7.1.3染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这是导致细胞活力比较低的重要原因； 

7.1.4实验中的一些操作不正确或不规范的情况、计算带来的误差等也会直接导致实验误差。

7.1.5取液时没有摇匀细胞液，导致取液不均匀。

7.1.6培养时间过长，养分耗尽。

7.2关于支原体污染

此次实验中，有同学培养的细胞被真菌污染，细胞被细菌或真菌污染时很容易检测和预防，而因为它极小，直径在0.2-2 μm，可以轻松地通过滤膜，混入培养系统中；而且它没有刚性的细胞壁，因此普通的抗生素对它根本不起作用。

基于以上两点，它即使生长到很高密度，也没有明显的污染迹象。

细胞培养，特别是传代细胞，被支原体污染是个世界性问题。

有研究报告称25%的细胞都存在支原体污染。

由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。

支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。

 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。

此次细胞培养实验几乎全部都是在无菌条件下进行，培养基和器材都保证无菌，并对实验操作进行了严格规范，基本能够保证避免支原体污染。

课后作业

1.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法

1.1MTT分析法

以活细胞代谢物还原剂3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

也可以用DMSO来溶解。

步骤：

a）接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

b）培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

c）呈色

培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

d）比色

选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2NCI所用的体外化疗药物筛选法

简单地说，NCI的体外化疗药物筛选系统由60种不同的人体肿瘤细胞株组成，测定每个受试化合物在一定浓度范围抑止各肿瘤细胞的生长的能力或细胞毒性程度。

以常规采用的筛选试验为例，在实验开始前一天，所有60种肿瘤细胞株细胞先接种在96孔细胞培养板上，然后将受试化合物10倍梯度稀释，一般最高浓度采用10－4mol。

每种化合物试验5种不同浓度。

样品加入细胞悬液后培育48小时。

此后用细胞染色法测定细胞的生长曲线，用sulforhodamine染色，再测定吸光度用以估计细胞数目。

根据比色结果画出60条剂量一反应曲线，然后计算出50％生长抑止浓度（GI50），100％生长抑止浓度（TGI）以及50％细胞死亡浓度（LC50）。

再将各细胞系的GI50、TGI和LC50汇总画出均数图，从此图可以大致看出该化合物对不同的肿瘤细胞株的抑制能力。

然后用计算机进行计算、模拟、比较，评价受试化合物的特征是否与某一类已知化疗药物类似，从而推测可能存在的抗癌机制。

据统计，NCI到目前为止已筛选了近460000种化合物。

用NCI体外化疗药物筛选系统得出的数据也可用于指导将来对主要化合物的改造，使化合物的药理及毒理性质更为理想。

1.3以分子生物学为基础的化疗药物筛选方法

近年来，对肿瘤的分子生物学研究取得了很大的进展，这给化疗药物的发展提供了一些新的目标。

现在已有许多采用X射线衍射、蛋白结晶、基因配对等方法来推断及设计抗癌药物。

这些方法往往开拓了一些全新的途径，但其缺点是这些化合物不一定对肿瘤细胞有选择性。

另外，这些化合物是否能进入肿瘤细胞也是一大问题。

因此，任何采用非细胞系统筛选的化合物都必须经过细胞系统以及合适的动物模型的检定才能进入临床试验。

1.4经典的化疗药物筛选模型

1985年NCI建立体外细胞筛选系统。

在此之前，NCI抗癌药物的筛选方法主要采用体内肿瘤模型来进行。

将白血病细胞株L1210及P388植入免疫缺陷鼠体内，待肿瘤长成后再给予不同剂量的筛选化合物，然后观察所试化合物是否能抑制肿瘤细胞的生长，甚至使肿瘤细胞死亡、消失。

然后再作计算分析，得出最小抑制剂量、中位抑制剂量、LC50等指标；以这些指标作为衡量受试化合物的抗癌作用强度。

这一方法的优点是得到的药物可穿过细胞膜以及某些生理屏障，缺点是所得到的药物仅对快速分裂的肿瘤（如白血病、淋巴瘤）疗效较好，而对实体瘤的治疗远不尽人意。

针对这一问题，NCI在1985年对抗癌药物的筛选过程作了如下重大改变：

①利用以肿瘤种类为指导的体外细胞筛选法取代体内筛选法；②利用实体瘤细胞株取代白血病细胞株；③用相对小量的原始材料用于初筛；④重新强调利用生物实验指导天然物中具抗癌活性成分的筛选。

体内实验的免疫缺陷鼠肿瘤模型现已不常用于药物的初筛，而常规用于对初筛所得的先导药物作进一步测试以观察评估化合物对不同的实体瘤的治疗作用。

2.诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选方法：

用待测药物诱导肿瘤细胞凋亡，并通过AnnexinV/PI法检测细胞凋亡及细胞死亡比例，分析不同作用时间以及不同药物浓度对肿瘤细胞凋亡的影响。

2.1诱导肿瘤细胞凋亡

肿瘤细胞在5%CO2孵箱培养至对数生长期，镜下计数为1×106/ml，加入24孔板，每孔1ml细胞悬液。

用无血清细胞悬液将待测药物配制成1mg/ml溶液；每组药物分别设4个浓度：

12.5、25、50、100μg/ml；分别加入24孔培养板，作3个复孔。

置于5％CO2孵箱培养。

2.2AnnexinV/PI流式双参数分析

分别于加入药物作用2、4和8小时，吸取培养细胞悬液，用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250μl结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml；取100μl细胞悬液，加5μlAnnexinV/FITC和10μl的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟；用PBS洗涤2次，进行流式细胞仪（FACS）分析。

AnnexinV-FITC/PI双参数进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测。

横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数，两个峰中的左边峰表示阴性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲线下面积越大凋亡就越多。

根据所测数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。

2.3统计学分析

各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以X±SD表示，多个均数的两两比较采用《中国医学百科全书•医学统计学》统计软件包PEMS3.1软件进行检验。