化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的检测方法.docx
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化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的检测方法
化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的
检测方法
（征求意见稿）
1适用范围
本方法规定了采用液相色谱-串联质谱法测定化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的方法。
本方法适用于水剂类、香波类、膏霜类和散粉类化妆品中替硝唑（CAS：
19387-91-8）、4-硝基咪唑（CAS：
3034-38-6）、2-甲硝咪唑（CAS：
88054-22-2）、羟基甲硝唑（CAS：
4812-40-2）、甲硝唑（CAS：
443-48-1）、二甲硝咪唑（CAS：
551-92-8）、特尼哒唑（CAS：
1077-93-6）、氯甲硝咪唑（CAS：
4897-25-0）、苯硝咪唑（CAS：
94-52-0）、塞克硝唑（CAS：
3366-95-8）、羟基异丙硝唑（CAS：
35175-14-5）、奥硝唑（CAS：
16773-42-5）、异丙硝唑（CAS：
14885-29-1）、羟基二甲硝咪唑（CAS：
936-05-0）、洛硝哒唑（CAS：
7681-76-7）等15种禁用硝基咪唑类抗生素的含量测定。
本方法中各化合物的检出限、定量下限及取0.5g样品时的检出浓度及最低定量浓度见表1。
表115种硝基咪唑抗生素的检出限、定量下限、检出浓度及最低定量浓度
化合物名称
检出限
/（ng/mL）
定量下限
/（ng/mL）
检出浓度
/（μg/g）
最低定量浓度
/（μg/g）
4-硝基咪唑
0.25
0.5
0.02
0.04
2-甲硝咪唑
0.25
0.5
0.02
0.04
羟基甲硝唑
0.25
0.5
0.02
0.04
羟基二甲硝咪唑
0.25
0.5
0.02
0.04
甲硝唑
0.25
0.5
0.02
0.04
二甲硝咪唑
0.25
0.5
0.02
0.04
洛硝哒唑
0.75
1.5
0.05
0.1
特尼哒唑
0.25
0.5
0.02
0.04
氯甲硝咪唑
0.75
1.5
0.05
0.1
苯硝咪唑
0.75
1.5
0.05
0.1
塞克硝唑
0.25
0.5
0.02
0.04
替硝唑
0.25
0.5
0.02
0.04
（续表）
化合物名称
检出限
/（ng/mL）
定量下限
/（ng/mL）
检出浓度
/（μg/g）
最低定量浓度
/（μg/g）
羟基异丙硝唑
0.75
1.5
0.05
0.1
奥硝唑
0.25
0.5
0.02
0.04
异丙硝唑
0.1
0.2
0.005
0.01
2方法提要
化妆品样品经过超声提取、高速离心及固相萃取后，用高效液相色谱-串联四极杆质谱进行检测分析。
与平行操作的甲硝唑等15种禁用硝基咪唑的标准品进行比较，以保留时间和优化的监控离子对进行定性，以其中信噪比较高、峰形好及背景干扰小的离子为定量离子进行定量，然后以标准曲线进行外标法定量。
3试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级用水。
3.1甲醇，色谱纯。
3.2乙腈，色谱纯。
3.3乙醇，分析纯。
3.4甲酸，色谱纯。
3.54-硝基咪唑，纯度≥97%。
3.62-甲硝咪唑，纯度≥99%。
3.7羟基甲硝唑，纯度≥99%。
3.8羟基二甲硝咪唑，纯度≥98%。
3.9甲硝唑，纯度≥99%。
3.10二甲硝咪唑，纯度≥98%。
3.11洛硝哒唑，纯度≥99%。
3.12特尼哒唑，纯度≥99%。
3.13氯甲硝咪唑，纯度≥98%。
3.14苯硝咪唑，纯度≥98%。
3.15塞克硝唑，纯度≥99%。
3.16替硝唑，纯度≥99%。
3.17羟基异丙硝唑，纯度≥99%。
3.18奥硝唑，纯度≥98%。
3.19异丙硝唑，纯度≥99%。
3.20空白化妆品样品：
被检测不含目标化合物成分的化妆品。
3.21固相萃取柱：
OasisHLB，6cc，500mg。
3.2215种硝基咪唑类抗生素的标准储备溶液：
准确称取10mg（精确至0.0001g）硝基咪唑抗生素标准品，置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释种刻度，混匀，得到每种硝基咪唑浓度为1000μg/mL的标准储备液。
3.2315种硝基咪唑类抗生素的混合标准储备液：
分别精密量取每种硝基咪唑抗生素的标准储备液（3.21）各5mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，混匀，得到50μg/mL的硝基咪唑类抗生素混合标准储备液。
3.2415种硝基咪唑类抗生素的标准工作液：
精密量取一定体积的混合标准储备液（3.22）置于10mL容量瓶中，用10%甲醇/水稀释至刻度，使得各硝基咪唑抗生素的浓度分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L。
4仪器和设备
4.1液相色谱-串联四极杆质谱仪。
4.2分析天平：
感量为0.001g。
4.3分析天平：
感量为0.0001g。
4.4超纯水器。
4.5涡旋振荡器。
4.6精密移液器。
4.7超声波清洗机。
4.8通风柜。
4.9旋转蒸发仪。
4.10氮吹仪：
配有加热装置。
4.11离心机：
离心速率可达5000rpm。
5分析步骤
5.1样品预处理
水剂类化妆品：
称取0.5g（精确至0.001g）水剂类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，冷却至室温后，用25%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50mL离心管中，以5000r/min离心10min，取3mL上清液过OasisHLB（6cc，500mg）固相萃取柱（预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡），先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL10%甲醇/水溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
香波类化妆品：
称取0.5g（精确至0.001g）香波类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液，涡旋振荡使得香波中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，冷却至室温后，用25%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50mL离心管中，以5000r/min离心10min，取3mL上清液过OasisHLB（6cc，500mg）固相萃取柱（预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡），先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL10%甲醇/水溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
膏霜类化妆品：
称取0.5g（精确至0.001g）膏霜类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液，涡旋振荡使得膏霜中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，冷却至室温后，用25%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50mL离心管中，以5000r/min离心10min，取3mL上清液过OasisHLB（6cc，500mg）固相萃取柱（预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡），先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL10%甲醇/水溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
散粉类化妆品：
称取0.5g（精确至0.001g）散粉类样品，置于10mL比色管中，加入50%甲醇/水溶液，涡旋振荡使得散粉中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，冷却至室温后，用50%甲醇/水定容至刻度，混匀，然后试样全部转移至50mL离心管中，以5000r/min离心10min，取3mL上清液过OasisHLB（6cc，500mg）固相萃取柱（预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡），先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL10%甲醇/水溶解残渣，过0.45μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
5.2液相色谱/质谱参考条件
5.2.1色谱参考条件
色谱柱：
C18色谱柱（2.1mm×150mm，3.5μm）；
流动相：
乙腈（A）和0.1%甲酸-水（B）；
梯度洗脱程序见表2；
表2梯度洗脱条件
Time（min）
Flow（mL/min）
A（%）
B（%）
0.00
0.25
5.0
95.0
2.00
0.25
5.0
95.0
17.00
0.25
35.0
65.0
19.00
0.25
95.0
5.0
20.00
0.25
95.0
5.0
20.10
0.25
5.0
95.0
22.00
0.25
5.0
95.0
注：
对于梯度洗脱条件，操作者可根据实际样品的不同而选择最佳色谱分离条件，使得禁用硝基咪唑类成分与其他组分峰获得分离。
柱温：
30℃；
进样量：
5μL。
5.2.2质谱参考条件
毛细管电压：
3.0kV；
萃取电压：
3.0V；
射频透镜电压：
0.1V；
离子源温度：
150℃；
脱溶剂气温度：
400℃；
脱溶剂气流量：
800L/hr；
锥孔气流量：
50L/hr；
碰撞室压力：
3.2×10-3mbar；
低质量端1分辨率：
3.0；
高质量端1分辨率：
15.0；
离子能量1：
0.5V；
碰撞室入口电压：
1V；
碰撞室出口电压：
1V；
低质量端2分辨率：
3.0；
高质量端2分辨率：
15.0；
离子能量2：
0.5V；
碰撞气体：
氩气；
数据采集模式：
MRM（多反应监测）。
0～2.5min：
不进入质谱仪分析，2.5～15min：
进入质谱仪分析。
15种硝基咪唑类抗生素的质谱参数见表3。
15种硝基咪唑类抗生素的MRM色谱图见图1。
表315种禁用硝基咪唑类抗生素的质谱相关参数
化合物名称
电离
方式
监控离子对（m/z）
锥孔电压（V）
碰撞能量（eV）
保留时间（min）
4-硝基咪唑
ESI+
114.2/68.2*
25
15
2.94
114.2/84.2
12
2-甲硝唑
ESI+
128.2/82.1*
20
15
3.97
128.2/111.1
15
羟基甲硝唑
ESI+
188.2/123.2*
20
15
4.18
188.2/126.2
14
羟基二甲硝咪唑
ESI+
158.2/140.2*
20
15
5.24
158.2/55.2
15
甲硝唑
ESI+
172.2/128.2
20
15
5.43
172.2/82.1*
20
二甲硝咪唑
ESI+
142.2/96.2*
25
15
6.26
142.2/81.2
20
洛硝哒唑
ESI+
201.2/140.2*
15
12
6.50
201.2/55.2
20
特呢哒唑
ESI+
186.2/128.2
20
15
7.05
186.2/82.2*
25
氯甲硝咪唑
ESI+
162.2/116.1*
25
17
8.38
162.2/145.1
15
苯硝咪唑
ESI+
164.2/118.2*
30
18
8.11
164.2/91.1
30
塞克硝唑
ESI+
186.2/128.2*
20
15
7.90
186.2/82.1
20
替硝唑
ESI+
248.2/121.2*
25
15
8.91
248.2/128.2
20
羟基异丙硝唑
ESI+
186.2/168.2*
20
15
10.07
186.2/122.2
20
奥硝唑
ESI+
220.2/128.2
25
15
10.65
220.2/82.1*
25
异丙硝唑
ESI+
170.2/124.2*
30
17
12.90
170.2/109.2
24
*：
定量离子对
图115种禁用硝基咪唑类抗生素的MRM色谱图
1.4-硝基咪唑；2.2-甲硝咪唑；3.羟基甲硝唑；4.羟基二甲硝唑；5.甲硝唑；6.二甲硝咪唑；7.洛硝哒唑；8.特呢哒唑；9.塞克硝唑；10.苯硝咪唑；11.氯甲硝唑；12.替硝唑；13.羟基异丙硝唑；14.奥硝唑；15.异丙硝唑
5.3定性判定
液相色谱-串联四极杆质谱对样品进行定性测定，在相同试验条件下，样品中被测禁用物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间应一致（变化范围在±2.5%之内）；样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表4规定范围，则可以判断样品中存在对应的禁用硝基咪唑类物质。
表4定性判定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度（k）
k≥50%
50%>k≥20%
20%>k≥10%
k≤10%
允许的最大偏差
±20%
±25%
±30%
±50%
5.4定量测定
在“5.2”项液相色谱-串联四极杆质谱分析条件下，用系列浓度基质标准工作溶液分别进样，以系列浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立基质标准曲线。
取“5.1”项下处理得到的待测溶液进样5μL，按“6”项公式计算，得出样品中禁用硝基咪唑的质量分数。
5.5平行试验
按照所建立的方法操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
6计算
W（目标物含量）=ρV/m
式中：
w——化妆品样品中硝基咪唑抗生素的质量分数，μg/g；
ρ——从标准工作曲线中得出的试样中硝基咪唑抗生素的浓度，μg/mL；
V——按稀释倍数折算的被测样总体积，mL；
m——试样取样质量，g。
7回收率和精密度
本方法在低、中、高3个添加水平范围内的平均提取回收率为80.00%～98.52%，相对标准偏差均小于5%，平均方法回收率为85.42%～108.33%，并且相对标准偏差均小于5%。
化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的
检测方法起草说明
为加强化妆品中禁限用物质的监督管理，国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2012年3月9日委托中国检验检疫科学研究院开展化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素检测方法标准建立和验证工作，现就起草工作有关情况说明如下：
一、起草的必要性
替硝唑、甲硝唑、奥硝唑和4-硝基咪唑等15种硝基咪唑类抗生素为临床常用的硝基咪唑类抗微生物药物，具有抗菌和消炎的作用。
我国已明确规定化妆品中严禁添加甲硝唑等硝基咪唑类抗生素，但仍有部分化妆品生产企业为追求经济利益，不顾消费者的健康安全，在生产过程中违法添加这些禁用物质。
在祛痘化妆品中违法添加甲硝唑等抗生素，虽然在短期内可能起到除螨、祛痘作用，但长期使用会刺激皮肤，引起接触性皮炎，严重时可导致对硝基咪唑类抗生素的耐药性，造成皮肤健康隐患。
因此，对化妆品中甲硝唑等违禁药物进行监督、检测，保证化妆品卫生质量十分必要。
根据所查文献，目前检测硝基咪唑类化合物的中文文献以有关蜂蜜、肉类、动物内脏和饲料等居多，国外学者对硝基咪唑类抗生素的研究也比较广泛，但鲜有化妆品中硝基咪唑化合物检测方法的报道和文献，主要研究对象为猪及家禽肌肉、动物肠衣、蜂蜜、血清、鸡蛋、动物排泄物等。
关于化妆品中硝基咪唑类化合物的文献较少，而且尚未见通过液相色谱-串联质谱联用方法同时检测化妆品中15种禁用硝基咪唑类化合物的报道。
本研究建立的液相色谱-串联质谱检测方法，灵敏、定性可靠、操作简单，可以快速同时检测化妆品中的15种禁用硝基咪唑抗生素，能够为化妆品中禁用硝基咪唑类抗生素的监测和风险评估提供参考依据。
二、起草依据及文献
（1）《化妆品卫生规范》
（2）《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》
（3）《欧盟化妆品管理法规及检测方法与指南（第二版）》
（4）徐娟，陈捷，邵琳智等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物[J].色谱，2011，29（5）：
450-453.
（5）殷居易，谢东华，刘永明等.蜂产品中9种硝基咪唑类药物原药及代谢物残留量的HPLC-APCI（+）MS/MS分析[J].分析测试学报，2009，28（8）：
935-939.
（6）刘永明，曹彦忠，李金等.液相色谱-串联质谱法快速测定蜂蜜中3种硝基咪唑类药物残留[J].色谱，2010，28（6）：
596-600.
（7）谢文，陈笑梅，丁慧瑛等.液相色谱串联质谱同位素稀释法对蜂王浆中10种硝基咪唑类药物残留的检测[J].分析测试学报，2010，29（5）：
497-501
（8）尚彬如，陈义强，张丽英.液相色谱-串联质谱测定饲料中7种硝基咪唑类药物[J].中国畜牧杂志，2011，47（3）：
66-70.
（9）李存，皇甫伟国，杨挺等.液相色谱串联质谱法快速测定猪尿中10种镇静剂类药物残留量[J].分析化学，2010，38（7）：
1015-1018.
（10）尚彬如，张丽英.硝基咪唑类药物检测技术研究进展[J].中国畜牧杂志，2010，46
（1）：
61-64.
（11）M.Gaugain,J.P.Abjean.High-performancethin-layerchromatographicmethodforthefluorescencedetectionofthreenitroimidazoleresiduesinporkandpoultrytissue.JournalofChromatographyA.1996,737:
343-346
（12）AertsRM,EgberinkIM,KanCA,KeukensHJ,BeekWM.Liquidchromatographicmulticomponentmethodfordeterminationofresiduesofipronidazole,ronidazole,anddimetridazoleandsomerelevantmetabolitesineggs,plasma,andfecesanditsuseindepletionstudiesinlayinghens.Journal-AssociationofOfficialAnalyticalChemists.1991,74:
46-55
（13）S.Semeniuk,A.Posyniak,N.Niedzielska.DeterminationofNitroimidazoleResiduesinPoultryTissues,SerumandEggsbyHigh-PerformanceLiquidChromatography.BiomedicalChromatography.199,59:
238-42
（14）NewkirkDR,RighterHF,SchenckFJ,OkrasinskiJLJr,BarnesCJ.Gaschromatographicdeterminationofincurreddimetridazoleresiduesinswinetissues.Journal-AssociationofOfficialAnalyticalChemists.1990,73:
702-4
三、起草原则
本检测方法兼具先进性与可行性，条理清晰，可操作性强，尽量采用目前化妆品检测实验室普遍具备的先进的分析技术，选择准确、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的可操作性和重现性。
四、起草过程
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2012年3月9日委托中国检验检疫科学研究院开展化妆品中甲硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素检测方法标准建立和验证工作，中国检验检疫科学研究院经过查阅国内外相关文献资料等调研工作后，开始了实验研究；2012年8月6日就该项工作的进展情况向国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司进行了汇报。
2012年10月～11月，中国科学院长春应用化学研究所、广东出入境检验检疫局技术中心、苏州出入境检验检疫局技术中心等三家单位对本项目建立的化妆品中甲硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素检测方法进行了验证，于11月上旬陆续将验证材料报送中国检验检疫科学研究院。
五、重点说明的问题
（1）关于体例
本检测方法的体例主要参照现行《化妆品卫生规范》（2007版）的卫生化学检测方法的体例，便于化妆品检验领域相关检测人员的阅读和实际操作。
（2）关于15种禁用硝基咪唑类抗生素
替硝唑、甲硝唑、奥硝唑和4-硝基咪唑等15种硝基咪唑类抗生素为临床常用的硝基咪唑类抗微生物药物，具有抗菌和消炎的作用。
在化妆品中违法添加甲硝唑等抗生素，虽然短期内可能起到除螨、祛痘作用，但长期使用会刺激皮肤，引起接触性皮炎，严重时可导致对硝唑类抗生素的耐药性，造成健康隐患。
我国已明确规定化妆品中严禁添加甲硝唑等硝基咪唑类抗生素。
（3）关于检测方法的建立和验证。
经过对化妆品样品前处理方法的摸索及分析测试条件的优化，最终建立了化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的液相色谱-串联质谱检测方法。
方法验证表明，本研究所建立的化妆品中15种禁用硝基咪唑的检测方法线性良好（相关系数大于0.99），检出限均低于2ng/mL，最低定量浓度均低于0.1μg/g，高、中、低三个浓度水平的平均方法回收率在85.42%～108.33%之间，相对标准偏差RSD小于5%，满足相关技术要求，表明所建立方法可以作为化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的检测方法。
三家实验室验证结果表明，回收率、精密度、标准曲线均符合要求，验证了所建立方法可以作为化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的检测方法。
化妆品中替硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素
检测方法编制说明
1任务来源
受国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司的委托，负责化妆品中甲硝唑、替硝唑、奥硝唑和4-硝基咪唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素检测方法的研制及标准起草工作，建立化妆品中甲硝唑、替硝唑、奥硝唑和4-硝基咪唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素快速、准确和灵敏的高效液相色谱串联质谱检测方法。
2研究背景
随着国民生活水平的提高和人们对美的追求，化妆品特别是一些日用的护肤
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