化学生物学小论文 18.docx

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化学生物学小论文18

化学生物学论文

班级：

2009级化学生物学班

姓名：

王丰

学号：

2009111127

酶结构的研究

王丰2009111127化学生物学

摘要：

本文简要叙述了酶的结构与其功能的关系，并介绍了蔗糖酶的具体研究方法。

关键字：

酶结构活性中心

1.酶结构研究的内容

从1834年德国博物学家施旺第一次分理出胃蛋白酶开始，人类对酶的结构与功能的研究就一直没有停下脚步。

通过对结构的研究，人们也在一步步揭示酶的秘密。

时至今日，人们甚至已经可以制作出一些人工酶，到底酶的结构是什么？

与功能又有什么关系呢？

所谓人工酶又到底是怎么一回事呢？

接下来，就一起走进酶的世界吧。

首先，在介绍酶的结构之前，先回顾一下酶的定义。

酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。

由于绝大多数酶是蛋白质，只有少数是核酸RNA（核酶），所以关于酶结构的研究，主要还是对蛋白酶的研究。

这里介绍的，也主要是蛋白酶的结构。

酶的结构，大体上可以分为：

一级结构，蛋白质（RNA）分子中碱基的排列顺序；二级结构，通过氢键形成的空间排布；三级结构，球状结构；四级结构，多亚基聚集体。

首先，我们先从最简单的一级结构开始介绍。

2.1.酶的一级结构

对酶而言，一级结构就是氨基酸序列，由于酶绝大多数都是蛋白质，而蛋白质的一级结构测定现在已经有了很多的方法，这里简单的介绍一下传统的蛋白质测序法。

蛋白质是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。

氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。

目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：

①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；

②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。

其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。

由于化学法较之酶法具有裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。

第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色谱进行分离分析。

由于篇幅原因，本文仅就较简单的蛋白质的N端氨基酸序列分析的原理和方法做一简单介绍。

1、耦联

蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯（PITC）试剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。

2、裂解

在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。

紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与PITC进行耦联反应。

3、转化

ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液（25％）中可转化成稳定的PTH—氨基酸。

4、PTH—氨基酸的鉴定

可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。

近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。

通常选用C—18反相柱进行分离。

此外，也有像“N端蛋白质序列仪”这样便捷的仪器，可以直接测出蛋白质的氨基酸序列。

2.2酶的二级结构以及活性中心的确定

酶的二级结构，本质上还是跟蛋白质相同的：

通过肽链上的羰基氧和亚氨基氢之间形成的氢键，使肽链主链骨架上的局部区域形成有规则的空间排布。

这种主链上的、有规则的空间排布称为蛋白质的二级结构。

包括：

α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。

2.2.1α-螺旋：

特点：

1、每隔3.6个AA残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;

2、螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧，链内氢键几乎都平行于螺旋轴;

3、每个氨基酸残基的>N-H与前面第四个氨基酸残基的>C=0形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。

其中，需要注意：

多聚赖氨酸在pH7的水溶液中不能形成α-螺旋，而是以无规则卷曲形式存在。

多聚亮氨酸由于R基团的空间阻碍不能形成α-螺旋。

多聚脯氨酸也不能形成α-螺旋。

2.2.2β-折叠：

β-折叠是二条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链的氨基与羰基氧形成氢键。

方式一——反平行：

肽链的N端不处于同一端，氢键与肽链走向垂直。

如：

丝心蛋白。

方式二——平行

所有肽链的N端处于同一端，氢键不与肽链走向垂直。

如：

β-角蛋白

2.2.3β-拐角结构：

β-拐角结构也称β-弯曲、β-回折、发卡结构等。

一般有4个连续的氨基酸组成。

在构成这种结构的4个氨基酸中，第1个氨基酸的羰基与第4个氨基酸的氨基形成氢键。

Gly和Pro易出现在这种结构中，因Gly的侧链简单，只有一个氢原子，在构象上没有空间障碍，可以缓和肽链弯曲时造成的残基侧链的作用。

Pro则相反，其亚氨基与侧链形成环状结构，严格的限制了构象角的自由度，在一定条件下，能导致β-拐角的形成。

2.2.4无规则卷曲：

如右图所示，泛指那些不能被归入明确的二级结构。

如折叠片或螺旋的多肽区段。

在各种蛋白质中，可同时存在几种二级结构，也可只有一种二级结构。

说完了蛋白质二级结构的空间排布，下来该轮到主角酶来展示自己的特性啦！

接下来着重介绍酶的特色——活性中心与其一级、二级结构的关系。

2.2.5酶的活性中心

酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。

大家都知道，在酶的分子中存在着许多功能基团，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。

一般将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团（结合基团，催化基团，维持活性中心存在的基团）。

那么，到底该如何寻找酶的活性中心呢？

·寻找酶的活性中心的方法：

方法一：

切除法

对小分子且结构已知的酶多用此法。

用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。

方法二：

化学修饰法

选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。

酶分子中可以修饰的基团有：

-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性的修饰剂不多。

某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。

不过这种方法也有失败的时候，例如也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。

为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团。

根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为：

1、非特异性共价共接修饰：

修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价修饰。

此法适用于所修饰的基团只存在于活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。

判断标准是：

①酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；②底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。

2、特异性的共价修饰：

修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。

方法三：

亲和标记法：

根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。

方法四：

X—射线衍射法：

把一纯酶的X—射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后的X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。

除此之外，酶的一级结构也与其活性中心有关，应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现，在酶的活性中心处存在频率最高的氨基酸残基是：

Ser、His、Asp、Tyr、Lys和Cys。

如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。

·酶的活性与高级结构的关系：

酶的活性与其高级结构密切相关。

就某种程度而言，在酶的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更为重要。

高级结构是形成酶特定空间结构的保证，高级结构破坏，酶失去活性。

而且活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%，并具有三维空间结构。

活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。

酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合。

酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙内.裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。

而底物则是靠许多弱的键力与酶结合。

·酶原激活

有些酶在细胞内合成时，或初分泌时，没有催化活性，这种无活性状态的酶的前体称为酶原。

酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。

酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。

例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位lys与第7位Ile残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶分子空间构象发生改变，产生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶。

酶原激活可以避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。

2.3酶的三、四级结构

2.3.1酶的三级结构简介

蛋白质分子的三级结构是指二级结构在空间的进一步盘曲、折叠而形成包括主链和侧链在内的三维排布。

若蛋白质分子是由一条肽链构成，三级结构就是其分子的立体结构。

若蛋白质分子具有四级结构，则三级结构是指其各条肽链或亚基的三维结构。

蛋白质分子在合成的时候就开始折叠形成三级结构，其合成是自发的。

蛋白质的折叠是指一个新合成的多肽链线性构象转化成为天然的特征三级结构的过程。

采用人工的方法合成的蛋白质分子也具有天然蛋白质的活性，证明其有与天然蛋白质相同的结构，这也说明蛋白质的天然结构的形成是自发的，并不需要人工对蛋白质进行结构上的再加工，让合成人工蛋白变的可能。

2.3.2酶的四级结构简介

蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级结构，分子中的每一个具有独立三级结构肽链，称为亚基。

而酶的四级结构就是指亚基间的空间排布、亚基间相互作用与接触部位的布局，不包括亚基本身的空间结构。

亚基间以次级键相连，绝无共价键。

3.固定化蔗糖酶的研究

蔗糖酶从酵母中提取，蔗糖在蔗糖酶的作用下，能得到比蔗糖溶解度更高、不易有结晶析出的高浓度转化糖浆，还原力增加，甜度增加。

蔗糖酶主要应用于制备蔗糖转化糖浆，还可用于软糖和巧克力糖软芯中防止出现蔗糖结晶，另外蔗糖酶还可用于从棉籽糖制备蜜二糖和从菊粉中制备果糖，以及降低果汁中蔗糖含量等。

对酶进行固定化开辟了酶的许多新用途。

蔗糖酶的固定化国内外研究相对较少。

包埋法是酶固定化的一种常见方法，条件温和，操作简单，对酶活性影响小，有利于小分子量底物的进入和小分子量产物的扩散，适合固定化。

本文利用包埋法就蔗糖酶的固定化及固定化酶的性质作了初步研究。

1材料与方法

1.1材料

蔗糖酶（实验室从酵母中提取），明胶，海藻酸钠，

氯化钙，戊二醛等。

1.2仪器

磁力搅拌器，酸度计，恒温水浴锅等。

1.3方法

1.3.1蔗糖酶的固定化

3.5mg蔗糖酶，0.4g氯化钙，0.5g明胶溶于l0mL醋酸钙缓冲溶液（25mmol／L，pH4.4）中，充分溶解，并降温至5℃～10℃，通过6号注射器的针头将上述冷却液以5cm的高度滴入到100mL的1％（w／v）的海藻酸钠溶液（用NaOH调pH8）中，过滤约得~U200个微球。

微球在醋酸钙缓冲溶液（25mmol／L，pH4.4）中硬化30min后，将微球置入到20℃、1％戊二醛溶液中进一步硬化2h，用醋酸钙缓冲溶液（25mmol／L，pH4.4）洗涤后，固定化酶置于用醋酸钙缓冲溶液（25mmol／L，pH4.4）中，贮存在0℃-5℃冰箱中准备在实验中使用。

1.3.2蔗糖酶的活力测定

12mL酶液（稀释率1：

300，w／v）与108mL蔗糖溶液（120g／L，pH5.5醋酸溶液）混合均匀，37℃反应10min。

用DNS法测定反应液中还原糖的量。

以煮沸酶液作对照，以lmin内催化释放1umol还原糖的酶量为1个酶活单位（U）。

固定化酶酶活测定的反应体系同游离酶，取适量固定化酶与底物混合，均匀搅拌反应10min，离心后取上清液，用DNS法测反应液中还原糖的量。

2结果与讨论

2.1蔗糖酶的固定化

2.1.1固定化酶活力回收率与加酶量的关系

固定化酶活力回收率（％）指固定化酶总活力与用于固定化的游离酶总活力的百分比，如图1示。

固定化酶活力回收率与所用的蔗糖酶的量有关，当蔗糖酶用量较低时，固定化酶活力回收率较高，这可能是由于蔗糖在微球膜上的扩散限制，并不能使所有的蔗糖酶都能发挥作用。

2.1.2固定化pH值的选择

选择不同的pH值进行蔗糖酶固定化，分别测定固定化酶活力回收率（％），结果如图2所示。

当pH4.4时，蔗糖酶活力回收率最高。

蔗糖酶的等电点为pH5，pH4.4时蔗糖酶带正电荷。

同时海藻酸钠是糖醛酸的钠盐聚合物，在高pH值（pH8）T，将有更多自由的羧基与钙、蔗糖酶等结合。

综合分析，pH4.4时，蔗糖酶活力回收率最高。

2.2固定化酶的性质

2.2.1最适pH值

在不同的pH值条件下，于40％分别测定在各种pH值下的游离酶与固定化酶的酶活，其酶活以不同pH值下的酶活占最适pH值酶活的比率表示，结果见图3。

从图3可知，蔗糖酶在pH4.0时有最高水解速度，在pH5.0时蔗糖酶仍保持较高的水解速度，在中性或微碱条件下酶水解速度迅速降低，pH8.0时，游离酶水解速度仅为最高时的10％。

固定化酶在pH3.0时亦有最高水解速度，pH5.0、pH6.0时，固定化酶仍保持较高的水解速度，当pH8.0时，凝胶变软，酶水解速度仅为最高时的40％。

由于在pH3.0时容易引起蔗糖的自然水解，所以应在pH4.0和4.5时进行酶解反应。

由此可见，虽然游离酶与固定化酶的最适pH值均为4.0，但固定化酶的pH值范围比游离酶要宽

2.2.2最适温度

在pH4.0和不同的温度情况下，分别测定游离酶与固定化酶的酶活，结果见图3。

从图3可知，游离酶和固定化酶的最适温度都为60℃，同时固定化酶稳定的温度范围比游离酶要宽，说明固定化酶对温度的耐受能力增强。

2.2.3米氏常数（Km）与最大反应速度

用蔗糖作底物，分别以不同浓度（20mmol／L一100mmoVL），在60℃、pH4.0下测定酶活力，以lmin时测定的酶活力代表酶促反应初速度，按Lineweaver—Burk作图法以1／V对1／[S]作图，见图4。

根据直线在横轴上的截距（一1／K求出米氏常数K，结果表明固定化酶的米氏常数（Km=49.05mmoVL）较游离酶（Km=45.45mmol／L）大，即固定化酶对底物的亲和力相对较小，这与固定化载体的空间障碍和扩散限制有关。

固定化酶的最大反应速度为35.2mg还原糖／（mg酶·min）较游离酶[V=45.45mg~原糖／（mg酶·min）]小，这也与固定化载体的空间障碍和扩散限制有关。

2.2.4固定化酶的储藏稳定性和操作稳定性

在温度为4℃时游离酶和固定化酶都稳定，但在室温下，10d后游离酶活性损失达15％，而固定化酶活力没有变化，这说明该固定化酶具有良好的贮藏稳定性。

固定化酶重复分批使用，结果见图5。

从图5可知，使用l0次后固定化酶的酶活未见明显损失，使用20次后固定化酶的酶活降低到78％，这是由于连续不断地搅拌导致固定化酶的凝胶结构和交联结构的改变而引起酶的泄漏。

实验说明该固定化酶具有一定的操作稳定性。

3小结

利用海藻酸钙凝胶球的包埋作用制各固定化蔗糖酶，游离酶被固定化后，最适pH值和最适温度没有变化，分别为4.0和60℃；但在高pH值和高温下，固定化酶比游离酶更为稳定；固定化酶的米氏常数（K~-49.05mmol／L）略大于游离酶的米氏常数（I~=45A5mmol／L），同时固定化酶明显提高了游离酶的储藏稳定性和操作稳定性。

由于蔗糖酶水解的底物（蔗糖）和产物（葡萄糖和果糖）都是小分子量物质，因此包埋法特别适合于蔗糖酶的固定化。

参考文献：

[1]固定化蔗糖酶的研究

[2]酶通论、酶的结构与功能

[3]蛋白质的一级结构（共价结构）

[4]蛋白质和多肽的氨基酸序列测定

[5]酶的作用机制和酶的调节

[6]蛋白质的结构与功能

[7]蛋白质的四级结构举例

[8]酶的研究及发现历史作者：

陈东生

[9]酶的活性中心及其作用

[10]蛋白质的三级结构及其作用

[11]蛋白质的二级结构

[12]酶分子结构研究技术在蛋白质工程领域的应用

[13]生物酶的特性

[14]α-淀粉酶的研究与应用

[15]植物乙酰辅酶A羧化酶性质和抑制剂研究

[16]蛋白激酶A的结构与功能