化学生物学小论文 6.docx

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化学生物学小论文6

化学生物学论文

班级：

2009级化学生物学班

姓名：

贺金峰

学号：

2009111145

胰蛋白酶的研究及应用

贺金峰2009111145化学生物学班

摘要:

以胰蛋白酶为例研究酶的结构与功能。

酶学知识来源于生产与生活实践。

我们祖先很早就会制酱和酿酒。

西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内（Kuhne）首先把这类物质称为酶（enzyme，其意“在酵母中”）。

1860年法国科学家巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。

1897年，Buchner兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。

1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。

1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶（1946年二人共获诺贝尔化学奖）。

1963年测定第一个牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三维结构（129aa）。

酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。

已发现的有两类：

主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。

美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。

酶所催化的反应称为酶促反应。

在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。

酶所具有的催化能力称为酶活性。

酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。

但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。

一、单纯酶和结合酶

单纯酶是仅由肽链构成的酶。

如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。

结合酶由蛋白质部分和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白（apoenzyme），决定酶的特异性和高效率；后者称为辅助因子（cofactor），决定反应的种类和性质。

两者结合形成的复合物称为全酶（holoenzyme），这两部分对于催化活性都是必需的。

酶蛋白有单条肽链和多个亚基组成的。

前者称为单体酶，为数不多，均为水解酶，如胰蛋白酶、核糖核酸酶、溶菌酶等；多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶称为寡聚酶，如磷酸化酶a，3-磷酸甘油醛脱氢酶等。

细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此嵌合形成的多酶复合体，即多酶体系，它利于一系列反应的连续进行，如丙酮酸脱氢酶体系、脂肪酸合成酶复合体。

在多酶体系中，能影响整条代谢途径方向和速度的酶称为关键酶，关键酶通常催化单向不平衡反应，或者是该多酶体系中催化活性最低的限速酶。

二、酶的辅因子

酶的辅助因子指金属离子或小分子有机化合物（又称辅酶与辅基）。

1.金属离子

约2/3的酶含有金属离子，常见的是K+、Na+、Mg2+、Cu2+（Cu+）、Zn2+、Fe2+（Fe3+）等。

金属离子的作用是多方面的：

参与酶的活性中心；在酶蛋白与底物之间起桥梁作用；维持酶分子发挥催化作用所必需的构象；中和阴离子，降低反应中的静电斥力。

2.辅酶与辅基

辅酶与辅基是一些化学稳定的小分子有机物，是维生素样的物质，参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。

辅酶与酶蛋白的结合疏松，可以用透析或超滤方法除去；辅基则与酶蛋白结合紧密，不能用上述方法除去。

一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合成一种特异的酶，但一种辅助因子可以与不同的酶蛋白结合构成多种特异性酶，以催化各种化学反应。

三、酶的活性部位

酶的活性部位（activesite）是它结合底物和将底物转化为产物的区域，又称活性中心。

它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维小区（为裂缝或为凹陷）。

酶活性部位的基团属必需基团，有二种：

一是结合基团，其作用是与底物结合，生成酶-底物复合物；二是催化基团，其作用是影响底物分子中某些化学键的稳定性，催化底物发生化学反应并促进底物转变成产物，也有的必需基团同时有这两种功能。

还有一些化学基团位于酶的活性中心以外的部位，为维持酶活性中心的构象所必需，称为酶活性中心以外的必需基团。

构成酶活性中心的常见基团有组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基等。

如丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，都催化蛋白质的肽键使之水解，但底物的专一性由它们的底物-结合部位中氨基酸基团的性质所决定，与其作用的底物互补。

像胰蛋白酶，在它的底物-结合部位有带负电荷的Asp残基，可与底物侧链上带正电荷的Lys和Arg相互作用，切断其羧基侧；胰凝乳蛋白酶在它的底物-结合部位有带小侧链的氨基酸残基，如Gly和Ser，使底物庞大的芳香的和疏水氨基酸残基得以进入，切断其羧基側；弹性蛋白酶有相对大的Val和Thr不带电荷的氨基酸側链，凸出在它的底物-结合部位，阻止了除Ala和Gly小側链以外的所有其他氨基酸。

胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme）为蛋白酶的一种，EC3.4.21.4。

在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。

胰蛋白酶由胰腺的腺泡细胞分泌的一种蛋白水解酶。

初分泌出时为无活性的胰蛋白酶原,经肠激酶激活成为有活性的胰蛋白酶,后者又可激活胰蛋白酶原和胰糜蛋白酶原,使它们成为有活性的酶,作用于蛋白质和多肽,生成小分子的多肽和氨基酸。

最适pH为8～9。

作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。

它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。

是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。

胰蛋白酶的晶体结构

随着生物制药的不断发展，因胰蛋白酶质量为题造成生物制药的质量安全问题也越来越引起人们的福安主。

目前胰蛋白酶在细胞工程方面的应用主要体现在疫苗的生产与研究，最终产品直接或间接应用于人体，因此，胰蛋白酶的质量好坏直接关系到人类的健康，甚至生命安全。

要控制好胰蛋白酶的质量安全，对原材料的把关是关键，由于胰蛋白酶来源于生物体，其成分复杂，单靠检验标准很难达到质量安全。

国内对细胞培养用胰蛋白酶制备尚不成熟，且大都对原材料没有进行严格的筛选，质量控制的研究内容也不够全面。

牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为23300，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。

除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘、放线菌等范围广泛的生物体中。

另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。

胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。

胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。

中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。

由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。

白色或米黄色结晶性粉末。

溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。

分子量24000，pI10.5，最适pH值7.8～8.5左右。

pH>9.0不可逆失活。

Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。

临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。

系统对比了罗非鱼肠道胰蛋白酶与猪胰蛋白酶的酶学特性,以揭示两种不同来源胰蛋白酶的性质异同,为水产胰蛋白酶的开发利用提供理论依据。

研究发现,罗非鱼肠道胰蛋白酶和猪胰蛋白酶的分子量分别为28kDa和24kDa;以Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐（BAPNA）为底物时,两种胰蛋白酶的最适pH分别为9.5、10.0;最适温度分别为40、50℃;罗非鱼肠道胰蛋白酶在pH4～11比较稳定,猪胰蛋白酶在pH2～6较稳定;两种胰蛋白酶的温度稳定性相似,均在55℃以下稳定;Na+、Cu2+、Ba2+对罗非鱼肠道胰蛋白酶的抑制作用强于猪胰蛋白酶,Mg2+、K+、Ca2+对罗非鱼肠道胰蛋白酶有抑制作用,而对猪胰蛋白酶有一定的激活作用。

两种胰蛋白酶均被大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）、甲苯磺酰氟（PMSF）强烈抑制,其中PMSF对罗非鱼肠道胰蛋白酶的抑制作用强于猪胰蛋白酶,乙二胺四乙酸（EDTA）对两种胰蛋白酶也有一定的抑制作用,但EDTA对猪胰蛋白酶的抑制作用强于罗非鱼肠道胰蛋白酶,而碘乙酸及2-巯基乙醇对两种胰蛋白酶抑制作用不大。

以研究羊胰脏提取胰酶工艺参数为目的。

用低浓度异丙醇做提取剂,高浓度异丙醇做沉淀剂,在单因素基础上,运用均匀设计法研究激活时间、沉淀剂浓度、提取pH值和CaCl2对羊胰酶提取工艺的影响。

胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶活力和胰酶提取率为响应指标,通过偏最小二乘回归（PLS）分析法对胰酶制备工艺的影响因素进行优化组合,并建立了具有制备条件的数学模型。

试验结果表明,羊胰酶制备最适条件为:

激活时间12h、沉淀剂浓度41%、提取pH值6.34和CaCl20.08%。

此条件下验证实测值胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的活力和胰酶提取率分别为3062.78u/g、30.06ku/g、32.37ku/g和6.16%,与理论预测值的相对误差分别为8.11%、1.28%、3.55%和5.29%。

进一步验证了数学二次多项式回规模性的适合性。

大豆乳清是工业上采用碱提、酸沉等工艺制备大豆分离蛋白的副产物。

目前,我国每年排放的大豆乳清废弃液在300万吨以上,这既造成了大量的资源浪费又造成了环境的污染。

而大豆乳清液中含有大量的功能性成分,如其中的胰蛋白酶抑制剂具有多种生理功能,在生物农药、医药等领域均有着广泛的应用前景。

对于胰蛋白酶抑制剂的分离、纯化工作,目前仅在实验室水平上采取水浸、酸提、盐析、凝胶过滤层析等较为繁杂的方法纯化制得,耗时长、产率和纯度也不高；还有利用琼脂糖凝胶亲和纯化制得,但其材料价格昂贵且活化时具有较大毒性。

黄曲霉在自然界中分布很广,能侵染饲料、花生、油料等各种食物,而黄曲霉侵染后所产生的黄曲霉毒素是化合物中毒性最强的有害物质之一。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。

经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。

收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。

一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。

如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。

乳腺癌严重威胁女性健康,发病率呈现逐年上升的趋势。

乳腺癌的危害主要体现在其转移,转移是指乳腺癌细胞由其原发部位侵入血管、淋巴管或者体腔后,被血流、淋巴流带到另一部位或器官,形成与原发瘤同样类型的肿瘤的过程,转移是乳腺癌患者死亡的最主要原因,也是该肿瘤恶性程度的重要标志和最本质的表现。

研究发现乳腺肿瘤的病理分型与肿瘤周围组织中肥大细胞数量密切相关。

良性肿瘤组织中肥大细胞较少,恶性程度高的浸润性小叶癌和浸润性导管癌组织中肥大细胞明显高于良性肿瘤（p＜0.01）,而恶性程度较低、浸润性不显著的黏液腺癌和髓样癌则介于高恶性和良性肿瘤之间。

近年来,肥大细胞与乳腺癌转移和侵袭之间的关系正逐步受到重视。

类胰蛋白酶是肥大细胞脱颗粒的主要成分,是一种具有胰蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶,目前其对乳腺癌侵袭力的影响未见报道。

本论文首先从健康人肺组织提取类胰蛋白酶,然后使用组织芯片技术研究类胰蛋白酶与乳腺癌病理分级、淋巴结转移之间的关系,继而在体外以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,观察了类胰蛋白酶对其侵袭力的影响及其机制。

参考文献：

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