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western blot）------试剂配制与操作步骤（2008-04-0116:

55:

48）

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杂谈 

蛋白印迹（westernblot）------试剂配制

1． 30%丙烯酰胺溶液　溶解29.2g丙烯酰胺和0.8gN,N’-亚甲基甲叉双丙烯酰胺于纯水中，搅拌至充分溶解后，定容至100ml。

过滤后于4℃避光保存。

2． 4×分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl,pH8.8）18.15gTris溶于80ml纯水中，用1mol/L盐酸调至pH8.8，定容至100ml。

于4℃保存备用。

3． 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl,pH6.8）6.055gTris溶于80ml纯水中，用1mol/L盐酸调至pH6.8，定容至100ml。

于4℃保存备用。

4． 10%过硫酸胺（APS，临用前配制）　过硫酸胺1.0g溶于10ml纯水中，充分混匀，4℃避光保存，一周内稳定。

5． 四甲基乙二胺（TEMED）

6． 10%SDS　10gSDS于100ml纯水中，缓缓搅拌使其完全溶解，室温保存。

7． 电泳缓冲液　称取3.0gTris，甘氨酸14.4g，溶于900ml纯水中，充分混匀，溶解后加入10%SDS10ml，定容至1000ml，混匀后室温保存。

8． 转移缓冲液　称取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶于700ml纯水中，充分溶解后，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室温保存。

9． 6×上样胶缓冲液　6ml上层胶buffer,1.2gSDS,少许溴酚兰，加热充分融解，加4ml甘油，加DTT0.9255g充分混匀后分装，-20℃保存备用。

10. RIPA裂解液　50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，溶解混匀后于4℃保存备用，临用前加入蛋白酶抑制剂（cocktail,1000×）至所需浓度。

11. 0.01%考马斯亮蓝染液　10mg考马斯亮蓝G-250，先加入10ml95%磷酸，5ml无水乙醇，搅拌至充分溶解后，定容至100ml，过滤后于4℃避光保存。

12.  0.02mol/LPBST缓冲液　称取Na2HPO4·12H2O7g,NaH2PO4·2H2O0.7g,NaCl9g,用900ml纯水搅拌溶解后，加入Tween-200.5ml，调节pH至7.4，纯水定容至1000ml，室温保存。

13.  印迹缓冲液　称取无脂蛋白粉1g溶解100ml0.02mol/LPBST缓冲液，搅拌混匀后，4℃保存，一周内稳定。

14.  30%H2O2

蛋白印迹（westernblot）------制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶

1．模具准备 用BIO-公司的mini型垂直板型电泳装置，宽窄两块玻璃板各一块，制备凝胶的厚度为1.5mm，固定在注胶架上，准备灌注凝胶。

2． 制备和灌注12.3%的分离胶（两块胶量）

在一50ml的离心管中，按顺序依次加入4×分离胶缓冲液4.0ml，纯水5.4ml，30%丙烯酰胺溶液6.6ml，10%SDS180µl，10%过硫酸胺溶液120µl，TEMED12µl。

混匀后立即注入模具腔，直至5.5cm左右的高度为止。

在凝胶上方加入纯水以进行水封。

当水封层与凝胶层之间出现明显的折光界面时（约40-60min），表明分离胶的聚合已经完成，用一注射器小心吸去水封层，准备灌注上层浓缩胶。

3.      5%浓缩胶的制备和灌注

在另一50ml离心管中，按顺序依次加入4×分离胶缓冲液2.0ml、纯水4.6ml、30%丙烯酰胺溶液1.34ml、10%SDS80µl、10%过硫酸胺溶液40µl和TEMED16µl。

混匀后，缓缓注入模具腔内分离胶的上面，直至液面与模具玻璃板上沿平齐。

小心将样品梳插入凝胶液体中，注意勿使其中产生气泡。

室温静置约30min后，浓缩胶聚合即完成。

将凝胶安装在电泳支架上，轻轻拔掉样品梳，立即用电泳缓冲液冲洗样品孔。

在电泳槽中加入电泳缓冲液至所需量，准备上样。

蛋白样品处理

取30µg蛋白样品（20µl），加入上样缓冲液4.5µl，β-巯基乙醇3µl，混匀，100℃煮沸5min。

加      样

将煮沸后的样品全部加入孔内，每泳道总体积为27.5µl。

电泳电压的配置

接通电源，先以60v电压恒压电泳。

至样品基本进入分离胶后，再改电压为100v，恒压电泳至电泳指示剂迁移到分离胶下游边缘时（约3-4h），停止电泳，准备转膜。

转      膜

以Bio-Rad半干式电转移装置进行操作。

取8cm×5.5cm硝酸纤维素膜一张，将膜及凝胶一起在转移缓冲液中平衡30min左右（PVDF膜先用甲醇泡两分钟），所用滤膜在转移缓冲液中浸泡5min左右。

按夹心法从下至上依次为滤膜、硝酸纤维素膜、凝胶和滤膜。

小心去除夹层内的所有气泡，盖上盖板，接通电源，0.16A恒流电泳80min，0.17A恒流电泳70min，0.2A恒流电泳60min。

蛋白印迹（westernblot）------染膜操作

1.     封闭硝酸纤维素膜　用无脂蛋白粉2.0g，加0.02mol/LPBST100ml，20-37℃封闭2h。

2.     用0.02mol/LPBST洗涤硝酸纤维素膜5min×2次。

3.     配制抗体稀释液　取95ml0.02mol/LPBST加入1.0g无脂蛋白粉和5ml浓缩抗体稀释液即可，4℃可保存一周。

4.     加一抗　用抗体稀释液稀释相应的一抗，20-37℃孵育3h或4℃过夜。

5.     用0.02mol/LPBST洗涤硝酸纤维素膜5min×4次。

6.     加二抗　用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗（1：

300），20-37℃孵育1h。

7.     用0.02mol/LPBST洗涤硝酸纤维素膜5min×6次。

8.     DAB显色　用0.02mol/LPBST稀释DAB浓缩液（40×），同时按1：

1000的比例加入30%H2O2,混匀后加至膜上，室温显色至所需颜色深浅，以蒸馏水洗涤终止显色。

干燥避光保存硝酸纤维素膜（每2mlPBST加一滴DAB加2ul30%H2O2）。

9.     或者ECL曝光 洗膜时间延长至8－10次，配底物：

900ul水＋50ul20´luminglo+50ulperoxide,将膜从PBST中取出后在虑纸上轻靠片刻去除多余水份，膜正面向上贴在塑封膜上，加底物反应1分钟，将膜放入曝光盒中（膜之间不要气泡）。

以下过程在暗室中进行，加底片曝光25秒至适当，取出底片置于显影液1之数分钟，水冲洗1分钟，定影1分钟，水冲洗1分钟。

（显影，定影液配置请见包装袋说明）

10. 观察、照相，将条带转换进电脑后进行分析。

11.  15％－15－45KD              12.5%--15-60KD

10%--18-75KD                  7.5%--30-120KD

5%--60-212KD

5%（上层胶）

7．5％

10％

12．5％

15％

ddH2O（ml）

2.3

4

3.3

2.7

2

Buffer（ml）

1

2

2

2

2

30%ACR（ml）

0.67

2

2.7

3.3

4

10%SDS（ul）

40

90

90

90

90

10%AP（ul）

20

60

60

60

60

TEMED（ul）

8

6

6

6

6

WESTERNBLOTTINGUSINGCHEMILUMINESCENCE

FabiolaPaulaLopes,AlicedeMoraesandPeterJ.Hansen

P.J.HansenHomePageMoreProtocolsfromtheLab

REAGENTS

ECLWesternblottingkit（AmershamLifeScience;cat#RPN2108）:

containssecondantibodiesforbothmouseandrabbit,substrateandmilkblocker（themilkblockerisnotnormallyusedwhenusingruminantsamples）.

HybondECLnitrocellulosemembrane（AmershamLifeScience;cat#RPN2020D）

KodakX-OMAT（XAR-5,18X24cm;cat#8532665）

10XTBS

12.11gTris-base（100mM）

87.66gNaCl（1500mM）

1literddH2O

AdjustpH=7.6

Washingbuffer（TBS-T）:

100ml10XTBS+900mlddH2O+1mlTween-20.

Blockingbuffer:

TBS-T+1.5%gelatin

IncubationbufferI（forfirstantibody）:

TBS+1.5%gelatin

IncubationbufferII（forsecondantibody）=blockingbuffer（i.e.,TBS-T+1.5%gelatin）

PROCEDURES

1-Immediatelyafterremovalfromtheblottingapparatus,placemembranesintoblockingbufferfor2hours.Asmallplasticgelboxisasuitablecontainer.Thisandallotherincubationstepsareperformedatroomtemperatureandintherockerplatform.

2-Washmembraneinwashingbuffer:

rinse2timesverybriefly,incubatefor15minutes,thenrepeat2xat5minuteseach.Usealotofbuffer.

3-Transferthemembranetoalidof96-wellmicrotiterplateorsimilarlowvolumecontainer.IncubatewithfirstantibodyusingrecommenceddilutioninTBS+1.5%gelatinduring2hours.Approximately10mlofdilutedantibodyshowedtobesufficient.

4-Transferthemembraneintogelboxandrepeatstep#2.

5-Transferthemembranebacktothesmallcontainerandincubatewithanti-mouseoranti-rabbitIgGhorseadishperoxidasediluted1:

8000inTBS-T+1.5%gelatinfor1hour.

6-Repeatstep#4（wash）

7-PrepareECLsolutionfordetection:

mixequalvolumeofECLreagent1and2,（1:

1）withfinalvolumeregardingof0.125ml/cm2（foraminigel-4mlofeachreagent）.

8-Removeexcessbufferfromthemembranebydrainingthemembraneoverapieceoffoldedkimwipepaperandbrieflytouchingtheedgeofthemembranetothepaper.

9-AddECLsolutionandincubatefor1minute.

10-Repeatstep#8（drainexcessofsubstrate）

11-Placemembranedownonseranwrap,removebubblesandwrapmembranecompletely.

Avoidexcessamountsofseranwrap.

12-Tapemembranetotheinsidefilmcassette.

13-Inthedark,add1sheetofx-rayfilmtothecassette.Exposemembranetofilm.Itwillprobablybenecessarytodoseveraldifferentexposurestofindoutthebestexposure.

14-Developthefilm.

1%的PBSA就是称1gBSA溶于100mlPBS中即可

BSA是买的sigma分装的，浓度1％

PBST就是PBS和Tween20

1、100mM的IPTG是2.4gIPTG溶于100ml水中：

按照标准的配法，它不应该直接溶于100ml水中；应该先溶于少于100ml的水中。

等溶解后再定容到100ml;.

2、在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22um滤器过滤除菌，分装成1ml小分储存与-20℃：

这个配的是20%的浓度，不是摩尔浓度。

是储存液。

实际用时通过计算加一定量就是了，便于保存。

免疫组化试剂盒（见下表）+DAB显色

两种纯化噬菌体DNA方法的比较

1材料和方法

噬菌体λgt11贮存液以合适的滴度铺平板成单一噬斑,挑取一个新鲜噬斑（滴度105~7pfu/ml放在100μlSM缓冲液中（氯化钠5.8g,硫酸镁2.0g,pH7.5,1mol/LTris-HCl50ml,2%明胶5ml,加水至1L）,4℃放置至少4h,让其充分释放。

加1ml108宿主菌（Y1090r）,37℃30min。

加入含1/100V0.5mol/LCaCl2的30mlLB培养液中（蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L）,37℃剧烈振摇5~7h,培养物可从清到混再变清。

加1ml氯仿继续在37℃振摇30min;离心（3400g,10min）除去细菌碎片,上清倒入干净的50ml离心管中,然后分两种方法继续操作:

①聚乙二醇（PEG8000）沉淀:

加RNA酶（10μg/ml）和DNA酶（1μg/ml）,37℃温育1h,加等体积含2mol/L氯化钠的20%聚乙二醇8000,置冰浴中2h,4℃12000r/min离心10min。

沉淀加0.5ml噬菌体缓冲液（20mmol/LTrisHClpH7.5；100mmol/L氯化钠；10mmol/L硫酸镁）,8000g4℃离心2min;上清转至微量离心管,用酚/氯仿抽提,12000r/min离心10min后,取水相加等体积之异丙醇,置-70℃20min,12000r/min离心10min。

沉淀用70%乙醇洗盐后置室温干燥,再溶于含RNA酶（1μg/ml）的TE中,37℃消化1h,以酚/氯仿抽提。

12000r/min离心10min后,取水相加半量体积7.5mol/L乙酸铵、2倍体积乙醇,置-70℃1h,12000r/min离心10min。

沉淀用70%乙醇洗涤后于室温干燥,最后重溶于100μlTE（10mmol/LTirs,HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0）。

②甘油超速离心:

上清加1/100V溶液A（500mg/mlRNase,50mg/mlDNase,30mmol/LpH6.8NaOAC,溶于50%甘油,贮存于-20℃）,37℃,30min,10000g离心10min。

上清缓慢加入一含有5ml40%甘油（溶于SM缓冲液中）的超速离心管中,以水平转头SW28,27000g,4℃离心60min。

沉淀用1mlSM缓冲液悬浮,加入1/5V溶液B（0.5%SDS,50mmol/LpH8.0Tirs.HCl,50mmol/LpH8.0EDTA）,再加入100μg/ml蛋白酶K,65℃,30min。

然后用pH8.0Tris.HCl平衡好的酚抽提1次,酚/氯仿抽提1次,氯仿抽提2~3次,用等体积的异丙醇沉淀,-20℃,30min,12000g,离心10min，沉淀用70%酒精洗1~2次,稍许干燥后,用200μlTE（10mmol/LTris,HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0）重溶。

2结果和讨论

用两种方法各提取5份噬菌体DNA,1~5号为甘油超速离心法所得,1′~5′号为聚乙二醇沉淀法所得（1和1′对应,余相同）。

各取5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳（1~5号为1/40量,1′~5′号为1/20量）见图1。

从图中看出,1~5号得率高,且无任何RNA污染;而1′~5′号除了有较多RNA污染外,得率也低得多。

图1两种不同方法提取并纯化的噬菌体DNA1%琼脂糖凝胶电泳图

注:

1~5号为甘油超速离心所得;1′~5′号为聚乙二醇沉淀所得

噬菌体载体作为一种有效工具已得到广泛应用,因此得到高质量的噬菌体DNA日益显得重要。

目前提取噬菌体DNA的方法较多,一般小量提取都遇到量少、不纯等难题[1]；大量提取又费时费力，纯化起来又麻烦（如氯化铯超速离心既昂贵，也费时[2]）。

本文比较了两种不同的提取方法,认为甘油超速离心法较适用,不但得到的DNA量多、质纯、而且也不费时,除了运用到超速率心技术外,无需其它特别仪器和试剂,值得推广。

用氯化铯离心法纯化噬菌体

[器材和试剂]

● L8—MBeckman超速离心机或与其相当的机型

● 吊桶式SWTi4l转头或相当类型

● 氯化铯（Sigma）

● PBS

● 纯化的噬菌体样本

[方法]

1．在每毫升最后的噬菌体悬液（例如来自实验方案13．11）中，加入0．45g氯化铯，充分混匀至溶解。

2．用吊桶式转头 （或与其相当的型号） 离心溶液，15℃17h，噬菌体将浓缩在组分1和组分2中（。

组分1的浓度较高，但组分2的体积较大。

用巴氏滴管或塑料注射器吸取这些组分。

如果是第一次使用本实验方案，那么先收集所有条带并分别对其检测将是明智之举。

3．将收获的溶液对PBS透析过夜。

4．通过感染大肠杆菌DH5cF，或TGl滴定各个不同组分中噬菌体，并保存滴度最高的组分。

通常，噬菌体会集中在1个区带内，而较少的数量会分散在其他区带（如果可见）。

加入甘油至10％；按每份样本1013个噬菌体等量分装并储存于-80℃。

更进一步的质量控制则可进行蛋白杂交印迹，采用抗标签抗体或抗pⅢ抗体。

用氯化铯纯化噬菌粒。

离心后离心管外观如图示。

噬菌体主要浓缩于碎片样区带（组分1）和其下的乳白色区带（组分2）。

两条区带均需收集

【摘要】 目的建立一种能很好模拟人体内生物学行为的胃癌裸小鼠原位移植和转移模型。

方法采用人胃癌SGC-7901细胞株在裸鼠皮下经反复传5代形成实体瘤的完整组织块，建立人胃癌裸小鼠原位移植生长和转移模型16个。

观察所建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率，常规H-E染色光镜下观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移情况。

电镜下观察肿瘤超微结构及免疫组化S-P法检测肿瘤诱导型环氧化酶-2（COX-2）。

结果胃癌裸鼠原位移植块再次原位移植的原位成瘤率达100％（16/16），淋巴结广泛转移率为87.5%（14/16），肝转移发生率为75.0％（12/16），腹腔积液形成率为12.5%（2/16）。

结论原位移植和转移模型均具有人胃癌自然生长过程的特点，具有人胃癌的生物学活性。

【关键词】 胃肿瘤肿瘤细胞原位移植疾病模型裸小鼠

   Establishmentoforthotopicimplantandmetastaticmodelsofhuman

   stomachcancerinnudemice

   LINQi1,ZHOUShifu2

   （1.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstPeople′sHospitalofLianyungang, Lianyungang,Jiangsu222000,China;

   2.DepartmentofOncosurgery,theForthPeople′sHospitalofWuxi,Wuxi,Jiangsu214000）

   Abstract：

Objective Todevelopanudemousemodelofhumangastriccancerthatcanmimicitsnaturalhumanbiologicactivities.Methods HumangastriccancercelllineSGC-7901wasculturedinnudemicerepeatedlyfor5generationstogetthe subcutaneoussolidtumor,whichwasthenemulsifiedandorthotopiclyinplantedintotheanteriorwallofthestomachin16nudemice.Thetumorgrowthcharacters,tumor-takerateandmetastaticratewerestudiedgrossly,thetransplantedtumoranditslymphaticandhepaticmetastases,afterroutineH-Estaining;theultrastructures,by electronmicroscopy;andCOX-2,byimmunohistochemicalmethod．Results Thetumor-takeratewas100％（16/16）,theratesofmetastasistolymphnode