实验动物学课件整理.docx
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实验动物学课件整理
实验动物学绪论
1实验动物的定义：
实验动物是指经人工培育的、遗传背景清楚、对其携带微生物和寄生虫实行控制、用于科学实验、教学、检定及药品、生物制品生产的动物。
2实验动物科学：
实验动物学是研究实验动物及其应用的科学
实验动物学是以生物学、动物科学、动物医学、医学、药理学、毒理学等学科为基础，综合发展而形成的一门覆盖面极广的边缘学科。
●目前大动物模型存在一定的缺陷：
1、与人存在着一定种属差异，不能完全模拟病原体在人体内的
感染模式
2、价格昂贵,饲养或维持费用高
3、数量少/无法用于大规模筛选
4、存在一定的伦理问题
结论：
人源化小鼠是理想的实验动物模型之一
3人源化的小鼠模型：
即对免疫缺陷小鼠品系进行人源细胞移植，在小鼠体内重建人的细胞和组织，包括
（1）hu-BLT人源化免疫系统小鼠模型
（2）Alb-uPA人源化肝脏系统小鼠模型
•人源化小鼠模型能够模拟
病原体在人体内的感染、
复制、病理变化及免疫应答
•繁殖迅速，饲养费用低，
饲养技术与饲养空间要求低
•动物实验操作简单
●动物伦理学发展的原因:
人类道德进步及文明程度提高，呼吁善待实验动物
●人为原因造成野生动物等的快速灭绝，引起人们忧虑，激发人们探究人在自然中的位置、动物的角色，人与动物之间的关系等问题
●虐待动物现象随处可见，引发反对虐待动物的动物福利和动物权利运动，而动物福利与动物权利运动需加以理论指导
4实验动物伦理：
是人与实验动物关系的伦理信念、道德态度和行为规范。
主要体现在尊重实验动物的价值和权利。
●Reduction（减少）
●Replacement（替代）
●Refinement（优化）
5实验动物福利：
实验动物的一种康乐状态。
在此状态下，其基本需求得到满足，而痛苦被减至最小。
6实验动物五项基本福利：
（1）提供适当的清洁饮水和食物，使动物不受饥渴之苦
（2）提供适当的栖息场所，能舒适地休息和睡眠，使动物不受困顿不适之苦
（3）预防疾病和给患病动物及时诊治，使动物不受疼痛、伤病之苦
（4）保证拥有良好的条件和处置（包括安乐死），使动物不受恐惧和精神上的痛苦
（5）提供足够的空间、适当的设施以及与同类动物伙伴在一起，使动物能够自由表达正常的习性
实验动物遗传特点及质量控制
1实验动物按遗传特点分类：
近交系（InbredStrain），封闭群（ClosedColonyorOutbredStock），杂交群（Hybrids）
2近交系（inbredstrain）
定义：
经连续20代以上的全同胞兄妹交配或亲子交配，近交系数（inbreedingcoefficient）达到99%，品系内所有个体都可追溯到第20代或以后代数的一对共同祖先。
近交系数：
群体中某个体通过遗传携带两个同源等位基因的概率。
命名：
一般以大写英文字母或大写英文字母加阿拉伯数字命名。
BALB,DBA,TA1,C3H等。
一些历史较长，已经广泛使用并获得认可的品系除外，如129等。
3亚系（Substrain）
定义:
由同一个近交系分离出来的有不同特性的分支，这些分支间有遗传差异，称为该品系的亚系。
亚系（Substrain）的形成：
㈠在兄妹交配20-40代时形成的分支；主要原因是残留杂合（Residualheterozygosity）；
㈡某分支与其它分支分开繁殖超过100代。
主要原因是突变；
㈢发现一个分支与其它分支的差异。
原因为残留杂合、突变或遗传污染（Geneticcontamination）。
命名:
在品系名称后加一道斜线（/），斜线后标明亚系的符号，亚系的符号可以是以下三种：
a） 数字，如DBA/1、DBA/2等。
b） 培育或产生亚系单位或人的缩写英文名称，第一个字母用大写，以后的字母用小写。
c） 当一个保持者保持的一个近交系具有两个以上的亚系时，可在数字后再加保持者的缩写英文名称来表示亚系。
如：
C57BL/6J，C57BL/10J分别表示由Jackson保持的C57BL近交系的两个亚系。
d） 作为以上命名方法的例外情况是一些建立及命名较早，并为人们所熟知的近交系，亚系名称可用小写英文字母表示，如BALB/c、C57BR/cd等。
4近交系的主要特征：
（1）、基因位点的纯合性
（2）、遗传组成的同源性（3）、表型的一致性（4）、长期遗传的稳定性（5）、遗传特征的可分辨性（6）、背景资料的完整性
5近交系名称中常见的缩写符号
f（fosternursing）:
代乳
o（ovary）:
卵巢移植
p:
表示移植的胚胎经过冷冻处理
e（egg）:
受精卵转输
BR:
BarrierReared隔离饲养法
CRL:
CharlesRiverLaboratories
CRJ:
CharlesRiverJapan
6近交系命名实例：
DBA/1fC57BL/6J
DBA:
小鼠品系名
1：
亚系名
f：
表示代乳
C57BL:
代乳母鼠品系名称
6：
亚系名
J：
亚系名
7特殊近交系：
（1）重组近交系
定义：
由两个近交系杂交后，经连续20代以上兄妹交配育成的近交系.
命名：
由两个亲代近交系的缩写名称中间加大写英文字母X命名。
（2）重组同类系
定义：
由两个近交系杂交后，子代与两个亲代中的一个进行数次回交（通常回交2次）而育成的近交系。
命名：
两个亲代近交系的缩写名称中间加小写英文字母c
（3）同源突变系
定义：
两个近交系，除了一个指明位点等位基因不同外，其它遗传基因全部相同的品系。
命名：
由发生突变的近交系名称后加突变基因符号（用英文斜体印刷体），二者之间以连接号分开，如：
DBA/Ha-D。
（4）同源导入系
定义：
通过杂交、互交（Cross-intercross）或回交等方式将一个基因导入到近交系中，由此形成的一个新的近交系与原来的近交系只在一个很小的染色体片段上的基因不同，也称同类系。
命名：
由以下三部分组成：
a.接受导入近交系缩写名称；
b.提供导入基因的近交系缩写名称并与a之间用英文句号分开；
c.导入基因符号（英文斜体），与b之间用连字符分开。
如：
B10.129-H-12b,
表示该同类系背景为C57BL/10,导入基因为H-12b,基因提供者为129。
8封闭群
定义：
亲交配方式进行繁殖生产的实验动物种群,在不从外部引入新个体的条件下,至少连续繁殖4代以上,称为一个封闭群,或叫远交群。
命名方法：
封闭群由2-4个大写英文字母命名,种群名称前标明保持者的英文缩写名称,第一个字母须大写,后面字母小写,一般不超过4个字母。
保持者名称与种群名称之间用冒号分开。
9封闭群动物的特点：
（1）成具有很高的杂合性
（2）具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成
（3）具有较强的繁殖力、生活力和抵抗力
10杂交群
定义：
杂交群：
由不同品系或种群之间杂交产生的后代。
杂交一代动物（F1代）：
两个不同近交系杂交所生的第一代动物。
命名：
雌性亲代名称在前，雄性亲代名称居后，二者之间以大写英文字母“X”相连表示杂交。
将以上部分用括号括起，再在其后标明杂交的代数（如F1、F2等）。
例如：
（C57BL/6XDBA/2）F1=B6D2F1
11选择近交系动物繁殖方法的原则是保持近交系动物的同基因性及其基因纯合性。
近交系动物的繁殖可分为
基础群（foundationstock）、
血缘扩大群（pedigreeexpansionstock）
生产群
选择封闭群动物繁殖方法的原则是尽量保持封闭群的动物的基因异质性及多态性
遗传监测的目的是为了证实各品系应具有的遗传特性，以及是否发生遗传突变和遗传污染等，以确保被监测的样品符合该品系的要求。
毛色基因测试法生化标记基因检测法下颌骨测定法皮肤移植法
12按微生物控制程度分级
1.普通级动物
（ConventionalAnimal,C.V）
2.清洁级动物除普通级动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体。
（CleanAnimal,C.L）
3.无特殊病原体动物简称SPF级动物，除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的动物。
在放射、烧伤等研究中具有特殊的价值。
国际上公认SPF动物适用于所有科研实验，是目前国际标准级别的实验动物。
各种疫苗生产所采用的动物应为SPF级动物。
（SpecificPathogenFree,SPF）
4.无菌动物（GermfreeAnimal,G.F）体内不存在任何可检测到的微生物及寄生虫。
包括悉生动物（gnotobiotesanimals，GN），也称为已知菌动物（Animalwithknownbacterialflora），是指动物携带或人工植入的确定生物体的一类实验动物。
这类动物一般用于特殊科研性实验。
1．形态学改变
（1）消化系统：
无菌动物和普通动物外观和活动之间看不出有特别的差异，有时仅见有体重增加的差别。
据报道，无菌动物的盲肠（包括内容物）的总重量有的可达到体重的25％，
（2）血液循环系统：
心脏相对变小，白细胞数少，且数量波动范围小，与无病原体入侵有关。
（3）免疫系统：
胸腺网状上皮细胞体积较大，胞浆内泡状结构和溶酶体少。
无菌兔胸腺以小淋巴细胞为主，胸腺和淋巴结处于功能较不活跃状态，脾脏缩小，无二级滤泡，网状内皮细胞功能下降。
2.生理学改变
（1）免疫功能：
由于网状内皮系统、淋巴组织发育不良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生丙种球蛋白的能力很弱，血清中IgM、IgG水平低，免疫功能处于原始状态.
（2）生长率：
无菌条件下对不同种属影响不同。
无菌禽类生长率高于同种的普通禽类；无菌大小鼠与普通鼠差不多；无菌豚鼠和无菌兔生长率比普通者慢，可能因肠内无菌，不能帮助消化纤维素以提供机体所需要的营养所致。
（3）生殖：
无菌条件对动物生殖影响不大。
大鼠和小鼠因出生后无感染，身体较好。
其繁殖力高于普通大小鼠；无菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低，可能因盲肠膨大之故。
（4）代谢：
血中含氮量少，肠管对水的吸收率低，代谢周期比普通动物长。
（5）营养：
无菌动物体内不能合成维生素B和K，故易产生这两种维生素的缺乏症。
（6）抗辐射能力：
抗辐射能力强，X射线照射无菌小鼠的存活时间较长，普通小鼠常因败血症而致死。
这是由于受损细胞的寿命在无菌小鼠与普通小鼠之间存在差别的缘故。
——不是因为辐射本身，而是因为辐射后感染（7）寿命：
无菌动物寿命普遍长于普通动物。
13检测频率
——普通动物：
每三个月至少检测动物一次；
——清洁动物：
每三个月至少检测动物一次；
——无特定病原体动物：
每三个月至少检测动物一次；
——无菌动物：
每年至少检测动物一次。
每2～4周检测一次动物粪便标本。
实验动物营养与饲料
1生物体从外界摄取维持自身生命所必需的物质及其消化、吸收和排泄过程称为营养;动物自发地从外界寻求到的营养物质称为食物;人类饲喂给动物的营养物质称为饲料;食物或饲料中所包含的各种营养物质统称为营养素。
2动物机体需要的营养素50余种，可以概括为七大类：
蛋白质脂肪碳水化合物矿物质维生素纤维素和水
3小鼠营养需要的特点：
•18-20%的蛋白质可满足需要；
•喜食含糖量高的饲料,糖的比重可适当大些；
•泌乳期喜食含脂类高的饲料；
•对维生素A的过量很敏感,特别是妊娠小鼠,过量会造成胚胎畸形；
•对维生素A和D的需要量较高，应注意补充。
影响动物营养需要的主要因素
遗传和环境因素
不同品种动物营养需要明显不同；
各品系间营养需要有明显差异；
在隔离或屏障环境中饲养动物其营养需要和同品系在普通环境中饲养动物的营养需要差别明显
4大鼠营养需要的特点
●18-20%的蛋白质即可；
●生长期的大鼠易发生脂肪酸缺乏，饲料中必需脂肪酸的需要量应占热能物质的1.3％；
●对镁的需要量较高，应注意补充；
●对营养缺乏敏感，易产生营养缺乏症
5实验动物饲料质量的一般要求
●各种原料和添加剂的营养指标应采用实测值
●营养指标均以90%干物质为基础
●配合饲料应混合均匀，新鲜、无杂质、无异味、无霉变、无发酵、无虫蛀及鼠咬
●各种实验动物配合饲料营养成分指标应符合国标要求
●需消毒灭菌饲料，应根据不同消毒灭菌方法，适当地提高相应营养成分的含量
●不得掺入抗生素、驱虫剂、防腐剂、色素、促生长剂以及激素等药物及添加剂
6饲料的消毒：
干热湿热辐照药物熏蒸
转基因动物和基因打靶
基因打靶（genetargeting）是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。
在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。
通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢?
根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。
因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体（targetingvector）。
基因打靶的结局有如下可能：
（1）基因击入（geneknock-in）在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。
（2）基因敲除（geneknock-out）受体细胞内源靶基因被灭活,。
（3）基因替代（genereplacement）靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。
（二）基因打靶的方法：
进行基因打靶要经历以下步骤：
（1）构建打靶载体。
基因打靶的关键在于构建打靶载体。
在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序（homologousrecombinationdirectingsequences,HRDS）。
外源基因插入这一同源序列之中。
长度可从3kb至15kb。
（2）打靶载体导入受体细胞（常用胚胎干细胞（embryonicstemcell，即ES细胞）。
基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞（ES细胞），ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。
小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎（孕3－5天）内细胞群分离的细胞。
1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。
1.电穿孔法
2.逆转录病毒载体3.脂质体包装法4.磷酸钙沉淀法
正负选择法的原理
在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶基因同源的序列，将新霉素抗性基因（neor）插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标（或者是靶基因最关键的外显子中）；neor可以抵抗G418.在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV－tk）基因序列作为负选择标志。
HSV-tK可以利用GANC而导致细胞死亡
（3）打靶ES细胞导入囊胚。
（4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。
同源重组：
如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组，外源基因以及neor基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上，而位于同源序列末端外的HSV-tk基因则在重组后丢失，此种情况下标志基因只有neor基因表达，则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在选择性培养基中存活下来。
打靶ES细胞的鉴定与扩增
筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆与囊胚体外共孵育或用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中，再将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育。
用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合体（chimera）小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基因打靶的ES细胞共同发育而来。
因此并非小鼠的全部细胞中都整合有导入的外源基因。
为获得纯合子的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交（back–cross）。
回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠（-/-）,即完全不携带有外源基因。
也有杂合子的小鼠（-/+）。
再用杂合子小鼠互交（intercross），从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因打靶小鼠。
再经繁育可建立转基因小鼠品系，其实验流程见下图。
（三）组织特异性基因打靶
应用ES细胞和同源重组原理而发展起来的基因打靶技术使转基因动物的研究又向前迈进了一步，但仍有其局限性。
主要问题是虽然通过基因打靶实现了外源基因在受体细胞基因组中的定点整合，但这种整合是没有组织特异性的，因此尚不能使外源基因仅在特定的组织中表达。
Cre/loxP系统的发现及应用实现了外源基因的组织特异性表达。
（四）外源基因的时间可控性表达：
实现了组织特异性基因打靶后，导入的外源基因表达时间仍是无法控制的，因而仍无法确定外源基因的表达在动物发育不同阶段中的作用。
另外，由于外源基因表达的时间不能控制，有时可造成转基因动物在胚胎期死亡。
为了解决这一问题，Mentzger等人（1995）用编码Cre重组酶与人雌激素受体（estrogenreceptor,ER）融合蛋白的基因制备了Cre–ER转基因小鼠，给这种转基因小鼠注射人雌激素，可诱导Cre–ER的大量表达。
再用插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反，则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。
转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。
整合的外源基因称为转基因（transgene）
受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称为全能性。
随着分化发育的进程，转基因会分布到各种组织细胞中去，包括生殖细胞，因此，转基因是可以遗传的。
最早建立成功的转基因动物是转基因小鼠（transgenicmouse）。
由于制备转基因小鼠比制备大的转基因动物要省时、省力得多,因此转基因小鼠技术作为生命科学研究的一个新的技术体系已经得到越来越广泛的应用，特别是基因功能的研究。
外源基因导入方法：
1.显微注射法2.逆转录病毒载体法。
3.电脉冲法。
转基因动物的应用1.基因功能的研究2.建立转基因动物生物反应器3.异种器官移植
转基因小鼠制备的基本程序：
1.选择小鼠品系，可以用远交系也可以用近交系。
一般采用两种近交系的杂交一代。
2准备不育雄鼠和假孕母鼠。
用输精管结扎的方法制备不育雄鼠，不育雄鼠与雌鼠交配可获得假孕母鼠。
3.收获受精卵-超排卵显微注射需要的受精卵可以通过小鼠自然交配得到，但数量常不能得到保证。
因而需对雌鼠施以激素以获得足够数量的受精卵——即诱导超排卵。
4-6周龄雌鼠在明暗循环的动物房内饲养3-5天，即可作超排卵。
一般以孕马血清（PMS）模拟卵泡刺激素（FSH），人绒毛膜促性腺激素（hCG）模拟黄体生成素（LH）。
PMS和hCG注射间隔42-48小时，排卵发生于注射hCG后10-13小时。
4.将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫内发育。
5首建转基因鼠（founder）中转基因的检测。
6.通过繁育建立转基因小鼠品系。
（1）.互交得到转基因纯合子小鼠
（2）.回交至少10代建立纯系转基因小鼠
实验动物环境与设施
实验动物设施（Laboratoryanimalfacility）
是从事饲养、育种、保种、生产、动物实验等的建筑物、设备以及运营管理在内的总和。
它是由实验动物繁育、生产设施和动物实验设施两部分组成。
2.实验动物繁育、生产设施（ProductionAnimalFacility）
指用于实验动物繁育、生产的建筑物、设备以及运营管理在内的总和。
3.动物实验设施（AnimalexperimentalFacility）
指以研究、试验、教学、生物制品、药品生产等为目的进行实验动物饲育、试验的建筑物、设备以及运营管理在内的总和。
按照“实验动物环境与设施”GB14925-2001规定，实验动物环境设施分为三级，控制程度从低到高，依次为普通环境（opencondition）、屏障环境（barriercondition）和隔离环境（Isolationcondition）。
1.普通环境（opencondition）：
该环境设施符合动物居住的基本要求，不能完全控制传染因子，适用于饲养教学等用途的普通实验动物（conventionalanimal）。
2.屏障环境（barriercondition）：
该环境设施适用于饲育清洁实验动物（Cleananimal）及无特定病原体实验动物（SPFspecificpathogenfreeanimal），该环境严格控制人员、物品和环境空气的进出。
3.隔离环境（Isolationcondition）：
该环境设施采用无菌隔离装置以保存无菌或无外来污染动物。
隔离装置内的空气、饲料、水、垫料和设备均为无菌，动物和物料的动态传递须经特殊的传递系统，该系统既能保证与环境的绝对隔离，又能满足转运动物时保持内环境一致。
该环境设施适用于饲育无特定病原体（SPF）、悉生（Gnotobioticanimal）及无菌实验动物（germfreeanimal）。
第二节 环境因素对实验动物的影响
◎实验动物外环境。
是指实验动物设施或动物实验设施以外的周边环境。
如气候或其他自然因素、邻近的民居或厂矿单位、交通和水电资源等。
◎实验动物内环境。
指实验动物设施或动物实验设施内部的环境。
内环境又细分为大环境和小环境。
前者是指实验动物的饲养间或实验间的整体环境状况;后者是指在动物笼具内，包围着每个动物个体的环境状况，如，温度、湿度，气流速度，氨及其他气体的浓度，光照，噪音等等。
•
影响实验动物的环境因素很多，这里主要阐述实验动物饲养室内的环境因素对实验动物的影响，例如温度、湿度、气流和速度、噪声、光照度、空气中的微生物和颗粒物等
（一）温度（Temperature）
•环境温度缓慢地变化，在一定范围内机体可以自行调节而适应。
但气温变化过大或过急对动物的健康将产生不良影响。
•温度对实验动物的影响表现在生殖、泌乳、机体抵抗力、形态、新陈代谢、实验反应性等方面。
温度对生殖的影响
•一般哺乳类实验动物，当温度过低时，常导致性周期的推迟,而当温度超过30℃时，雄性动物出现睾丸萎缩或形成精子的能力下降;雌性动物出现性周期的紊乱,泌乳能力降低或拒绝哺乳等。
如金黄地鼠，当温度低于18℃时,可发生吃仔现象；13℃时，可引起幼鼠死亡；临近4℃时，经短时间即可进入冬眠。
温度对机体抵抗力的影响
•温度过高或过低都能导致机体抵抗力降低，而患病。
大鼠在31℃、鸡在35℃高温应激作用下,出现需氧菌（葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属）菌群的增加,鸡还出现厌氧菌的消化道链球菌、梭状芽胞杆菌属增加的现象。
将BALB/c小鼠从22℃环境移到12℃环境内，其白细胞数发生变化，与免疫反应有关的血液及脾脏中Ｂ和Ｔ细胞的比率亦出现明显变动，免疫功能的异常与疾病发生关系很大。
温度对动物形态方面的影响
•低温环境下繁殖饲养的小鼠其尾长明显缩短；大鼠在10℃繁殖时其尾长比在30℃条件下约短2cm;喜玛拉雅兔在20℃时,耳、尾、鼻和四肢尖端长白毛,10℃时则长黑毛。
温度对动物实验的影响
•环境温度不同常使同种动物实验出现不同结果:
如不同温度下饲养的小鼠对药物的半数致死
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