环氧合酶2和ki67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达.docx

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环氧合酶2和ki67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

环氧合酶-2和ki-67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

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【摘要】目的研究环氧合酶-2（COX-2）和ki-67在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变（CIN）、宫颈鳞状细胞癌（SCC）中的表达及其相关性。

方法RT-PCR法检测COX-2mRNA在正常、炎性、CIN组织和SCC组织中的表达；免疫组化法检测各组中COX-2和ki-67蛋白的表达。

结果COX-2mRNA和蛋白在正常组无表达，在炎性、CIN和SCC组表达升高（P0.05），COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度有关（P0.05）。

ki-67在正常组中偶有表达，在炎性组和CIN组表达增高，在SCC组显著增高（P0.01）。

COX-2与ki-67蛋白的表达相关（r=0.675，P0.001）。

结论COX-2表达增高可能是宫颈癌发生发展的早期事件，与细胞异常增生有关。

【关键词】环氧合酶-2；Ki-67；宫颈癌；细胞增殖　　ABSTRACT:

ObjectiveTostudytheexpressionofcyclooxygenase（COX-2）andki-67inchroniccervicitis,cervicalintraepithelialneoplasia（CIN）,squamouscarcinomaofthecervix（SCC）andtheirrelationship.MethodsTissuesampleswereharvestedrespectivelyfromnormal,inflammational,CINand30SCCtissues.TheexpressionofCOX-2mRNAwasdetectedbyRT-PCRmethod.COX-2andki-67proteinsweredetectedbyinmmunohistochemicalmethod.ResultsTheoverallexpressionofCOX-2mRNAandproteinwashigherininflammation,CINandSCCgroupsthanthatinnormalcervix（P0.05）.COX-2proteinexpressionwascorrelatedwithtumorsizeandinvasiondepth（P0.05）.Ki-67proteinwashigherintheothergroupsthanthatinnormalcervix（P0.05）.Ki-67wasexpressedinSCCgroupatahighlevel,whichsignificantlydifferedfromtheexpressionininflammationgroup（P0.01）.AsignificantcorrelationwasfoundbetweenCOX-2andki-67protein（r=0.675,P0.001）.ConclusionCOX-2maybeanearlyincidentofsquamouscervicalcarcinogenesisrelatedtocellproliferation.　　KEYWORDS:

cyclooxygenase-2;ki-67;cervicalcarcinoma;cellproliferation环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是炎症反应中催化前列腺素合成的一个限速酶。

有研究发现COX-2在结肠癌、食管癌、宫颈癌中表达升高，其表达同免疫抑制、血管生成、抗凋亡和细胞增殖有关，影响肿瘤的发生发展［1-3］。

ki-67抗原为细胞分裂增殖相关蛋白，可识别生长中的细胞，评估细胞增生［4］。

本研究通过检测COX-2和ki-67在宫颈正常组织、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变（cervicalintraepithelialneoplasia,CIN）、宫颈鳞状细胞癌（squamouscarcinomaofthecervix,SCC）中的表达，探讨COX-2在宫颈癌发生发展中的作用和机制。

　　1材料与方法　　1.1标本来源与分组　　实验分2组，实验组均取自西安交通大学医学院第二附属医院2005年11月至2006年3月手术切除并经病理学证实的标本。

其中宫颈癌组30例，患者年龄32-72岁，平均（44.23±8.85）岁；对照组包括，慢性宫颈炎10例，患者年龄29-43岁，平均（30.58±10.25）岁；CIN10例，患者年龄37-50岁，平均（46.50±3.94）岁；正常宫颈10例，患者年龄29-43岁，平均（37.52±6.84）岁。

所有病例术前2周内均未服用消炎痛、阿斯匹林等影响前列腺素代谢的药物。

采得的新鲜组织2份，1份液氮处理后，-80℃冰箱冻存以备RT-PCR检测，另1份4%（体积分数）甲醛溶液固定，石蜡包埋，以备免疫组化染色。

　　1.2RT-PCR法及结果判定　　β-actin（303bp）用于内对照，PBS液代替引物作为阴性对照。

总RNA提取后，紫外分光光度计（美国NanoDropND-100Spectrophotometer仪）检测RNA纯度（1.6），计算出RNA浓度，取2μg进行RT-PCR。

引物设置：

COX-2（530bp）上游引物：

AAGCCTTCTCTAACCTCTCC；下游引物：

TAAGCACATCGCATACTCTG；β-Actin（303bp）上游引物：

AGCGGGAAATTGTGCATG；下游引物：

CAGGGTACCTGGTGGTGCC（由陕西理生医疗科技有限公司合成）。

在同一反应体系，按照RT-PCR酶混合物试剂（陕西理生医疗科技有限公司）说明结合参考文献［5］提供的逆转录系统及参数进行RT-PCR：

37℃反应30min，95℃3min灭活逆转录酶后95℃变性30s，57.4℃退火30s，72℃延伸30s，反应30个循环。

取扩增产物进行0.5mg/L琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。

用凝胶成像系统进行半定量分析（美国Bio-Rad凝胶成像分析仪，型号：

GelDocEQ），取目的基因条带和β-actin条带强度的比值作为目的基因的相对值。

　　1.3免疫组化染色及结果判定　　常规切片（4μm），脱蜡，柠檬酸沸水修复抗原，其余步骤按SP免疫试剂盒（北京中山试剂公司产品）说明操作。

抗COX-2多克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体购自北京中山试剂公司，工作浓度分别为1∶1200，1∶200。

用已知膀胱癌阳性片作阳性对照，PBS液代替一抗作阴性对照。

结果判断：

COX-2阳性染色主要为胞质，少数为核膜着色。

ki-67阳性染色主要为胞核和核膜着色。

免疫组织化学标本经Image-proplus图像分析软件进行图像分析［6］，每个标本随机选取3个高倍视野，测定单位面积下平均灰度值，最后求每张切片的平均灰度值及标准差。

本次测量灰度值标准，极白为255，极黑为0，共256阶。

故染色越浅，灰度值越大；染色越深，灰度值越小，考虑背景色的误差，将灰度值≥200者视为阴性。

　　1.4统计学处理　　所有数据用SPSS11.5统计软件处理。

多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间均数比较根据方差是否齐性采用t或t′检验，等级资料采用Spearman相关系数分析，两组计量资料之间的关系采用Pearson相关系数分析，P0.05为有统计学意义。

　　2结果　　2.1COX-2mRNA和蛋白的表达　　COX-2蛋白在正常组无表达，炎性、CIN组、SCC组表达依次升高，与正常组比较具有统计学差异（P0.05），但病变各组间无统计学差异（P0.05，表1）。

宫颈病变各组COX-2蛋白表达阳性率增高。

COX-2mRNA在正常组不表达，宫颈病变各组表达升高（图1），但与蛋白表达不完全一致（r=0.135，P=0.68）。

表1COX-2在不同的宫颈组织中的表达（略）　　2.2ki-67蛋白在宫颈组织中的表达　　ki-67在正常宫颈组偶有表达，炎性、CIN和SCC组中表达依次升高，与正常组比较具有统计学差异（P0.05），炎性组同SCC组比较具有统计学差异（P0.01，表2）。

宫颈病变各组ki-67蛋白表达阳性率增高，COX-2在CIN和SCC组表达阳性率高于ki-67。

　　2.3COX-2和ki-67蛋白表达范围及其与临床病理特征的关系　　炎性和CIN组中，ki-67主要分布在宫颈的副基底层细胞（parabasalsquamouscells）（图2、3），SCC组中ki-67表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞（图4、5）。

COX-2表达范围较ki-67广泛。

CIN组COX-2除表达于副基底层异常的细胞外，病灶周围正常细胞及炎性细胞也有表达，偶见于新生血管内皮细胞，其表达随着与病灶距离的增加而减弱（图2、3）；SCC组COX-2除表达于肿瘤细胞外，癌灶周围的炎性细胞及血管内皮细胞也有表达（图4、5）。

COX-2蛋白表达与肿瘤的体积和浸润深度有关（P=0.04，P=0.02），ki-67表达与任何病理特征均无关（表3）。

宫颈病变各组ki-67和COX-2的蛋白表达存在显著直线相关（r=0.675，P0.001，图6）。

表2ki-67蛋白在宫颈组织中的表达（略）表3COX-2和ki-67蛋白在SCC组中的表达（略）　　3讨论持续性人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）感染是CIN或宫颈癌发生的一个重要驱动力［4］。

HPV清除与细胞介导免疫高度相关［7］。

Huan等［8］比较宫颈癌癌灶和癌周组织的细胞因子，发现白介素-10（interleukin-10,IL-10）在肿瘤组织中的表达增强，后者与体液介导免疫有关。

在慢性炎症过程中，机体的免疫反应由细胞介导免疫转化为体液介导免疫，COX-2在这一过程中起着重要作用。

研究发现COX-2与人类肿瘤关系密切，其作用机制可能与免疫抑制和细胞增殖有关。

ki-67是一个细胞增殖的重要分子标记物。

宫颈上皮中，ki-67阳性细胞核的分布范围，可以将CIN病变等级准确分类［4］。

John［9］研究在CIN病灶周围的正常细胞，轻度、中度、重度病变细胞中COX-2的表达阳性率，分别为10%、28%、37%、67%，病灶切缘COX-2的表达还可作为一个监测CIN预后的独立指标（相对危险度=0.68）。

John考虑到COX-2染色超过病灶组织平均约1.6mm，故宫颈环状电切术（loopelectrosurgicalexcisionprocedure,LEEP）切除的组织应超过CIN病灶2mm以防止复发。

这一研究提示COX-2表达阳性的细胞，即使组织学形态仍然正常，其生物学行为已经发生改变，易于发展为CIN。

本实验中，CIN组，COX-2在病变细胞及其周围正常细胞均有表达，其表达范围随着与病灶距离的增加而减弱；SCC组COX-2蛋白的表达与肿瘤体积和浸润深度相关（P=0.04，P=0.02）。

提示COX-2可能参与宫颈癌病变的发生发展。

Kim等［3］发现宫颈癌中COX-2表达增高的组，其ki-67表达阳性率也增高，故认为COX-2表达与ki-67相关。

Ferrandina等［10］应用COX-2抑制剂治疗宫颈癌，发现其可以抑制癌细胞增殖，使ki-67表达降低。

本实验中，COX-2与ki-67表达存在显著正相关（r=0.675，P0.001）。

ki-67与COX-2蛋白表达范围不同，在CIN和SCC组中，ki-67仅在病灶中表达，COX-2在病灶及其周围组织均表达，其表达阳性率高于ki-67。

结果提示：

COX-2表达增高是较ki-67更早的细胞生物学行为。

不同于ki-67仅表达于病变组织，COX-2在CIN病灶周围正常组织中表达增高，使细胞生物学行为改变，调节宫颈组织局部免疫，促进细胞增殖，产生一个更利于细胞恶变的微环境，影响肿瘤的发生发展和预后。

COX-2促进细胞增殖的确切机制尚不十分清楚，可能与其主要产物PGE2有关。

Dai等［5］发现COX-2mRNA和蛋白在宫颈病变各组的表达升高，mRNA表达阳性率高于蛋白，认为COX-2可能存在转录后调节。

Debnath等［11］研究宫颈癌细胞株紫外线照射下不同时段COX-2的表达，认为射线刺激COX-2mRNA表达量增高，而mRNA稳定因子CUGBP2表达也升高，COX-2蛋白表达被抑制，其量没有明显改变。

本实验中，COX-2mRNA和蛋白在宫颈病变各组表达均升高，但两者表达不完全一致（r=0.135，P=0.68）。

这种差异是否与这一稳定因子有关尚待进一步研究。

COX-2蛋白表达增高可能是细胞生物学行为改变的早期事件。

COX-2通过调节宫颈局部免疫，影响细胞增殖，促进一个更利于细胞恶变的环境产生，促使宫颈由慢性宫颈炎向CIN和SCC转变。

COX-2在宫颈癌早期发生阶段起着重要作用，这为预防宫颈癌提供了新的思路。

【参考文献】　　［1］SatoT,YoshinagaK,OkabeS,etal.Cyclooxygenase-2expressionanditsrelationshipwithproliferationofcolorectaladenomas［J］.JpnJClinOncol,2003,33（12）:

631-635.　　［2］JangJT,ChoMY.Cyclooxygenase-2expressionandcellproliferationareincreasedinMUC2-positzveareaofcolumnar-linedesophagus［J］.PatholIntern,2005,55（5）:

546-549.　　［3］KimYB,KimGE,PyoHR,etal.Differentialcyclooxygenase-2expressioninsquamouscellcarcinomaandadenocarcinomaoftheuterinecervix［J］.IntJRadiatOncolBiolPhys,2004,60（3）:

822-829.　　［4］罗布依，安德森，拉塞尔.宫颈癌病女性生殖道病理学［M］.北京：

北京大学医学出版社，2005:

153-160.　　［5］DaiY,ZhangX,PengY,etal.Theexpressionofcyclooxygenase-2,VEGFandPGsinCINandcervicalcarcinoma［J］.GynecolOncol,2005,97

（1）:

96-103.　　［6］陶洪，侯铁舟，王强.氟对体外器官培养人牙胚骨形成蛋白表达的影响［J］.西安交通大学学报（医学版）,2003,24

（2）:

124-126.　　［7］O’ByrneKJ,DalgleishAG.Chronicimmuneactivationandinflammationasthecauseofmalignancy［J］.BritJCancer,2001,85（4）:

473-483.　　［8］NguyenHH,BrokerTR,ChowLT.Immuneresponsestohumanpapillomavirusingenitaltractofwomenwithcervicalcancer［J］.GynecolOncol,2005,96（3）:

452-461.　　［9］FarleyJ,UyeharaC,HashiroG,etal.Cyclooxygenase-2expressionpredictsrecurrenceofcervicaldysplasiafollowingloopelectrosurgicalexcisionprocedure［J］.GynecolOncol,2004,92

（2）:

596-602.　　［10］FerrandinaG,RanellettiFO,LeggeF,etal.Celecoxibmodulatestheexpressionofcyclooxygenase-2,ki67,apoptosis-relatedmarker，andmicrovesseldensityinhumancervicalcancer:

apilotstudy［J］.ClinCancerRes,2003,9（12）:

4324-4331.　　［11］MukhopadhyayD,JungJ,MurmunN,etal.CUGBP2playsacriticalroleinapoptosisofbreastcancercellsinresponsetogenetoxicinjury［J］.AnnNYAcadSci,2003,1010（16）:

504-509.