杏鲍菇深层发酵培养基的优化.docx

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杏鲍菇深层发酵培养基的优化

本科毕业论文

杏鲍菇深层发酵培养基的优化

StudyontheMediumofSubmergedFermentationforPleorotuseryngii

学院名称：

生物与食品工程学院

专业班级：

学生姓名：

学号：

2014年5月

毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明

原创性声明

本人郑重承诺：

所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。

尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得安阳工学院及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。

对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。

作者签名：

　　　　　日　期：

指导教师签名：

　　　　　日　　期：

使用授权说明

本人完全了解安阳工学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：

按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。

作者签名：

　　　　　日　期：

目录

摘要……………………………………………………………………………………Ⅰ

Abstract………………………………………………………………………………Ⅱ

引言1

第一章绪论3

1.1食用菌生产状况3

1.2食用菌液体菌种的研究现状3

1.3应用前景及方向4

1.3.1食品工业上的应用4

1.3.2生物医药产业上的应用4

1.3.3其它行业上的应用4

1.4杏鲍菇的研究状况4

第二章材料与方法7

2.1试验材料7

2.1.1杏鲍菇菌种7

2.1.2培养基7

2.1.3试验原材料7

2.1.4仪器设备7

2.2试验方法7

2.2.1母种活化7

2.2.2一级摇瓶菌种7

2.2.3摇瓶发酵培养7

2.2.4试验设计8

2.2.4.1碳源单因素试验8

2.2.4.2氮源单因素试验8

2.2.4.3无机盐单因素试验8

2.2.4.4生长因子单因素试验8

2.2.5不同配比的营养因子对杏鲍菇菌丝体生长的影响8

2.2.6液体培养基最适pH试验9

2.2.7称量菌丝体的干重9

第三章试验结果与分析10

3.1碳源单因素试验结果10

3.2氮源单因素试验结果10

3.3无机盐单因素试验结果11

3.4生长因子单因素试验结果11

3.5营养因子不同配比对杏鲍菇菌丝生长的正交试验结果12

3.6不同起始pH对杏鲍菇菌丝生物量的影响13

结论14

参考文献15

致谢17

杏鲍菇深层发酵培养基的优化

摘　要:

本文用液体培养法，以菌丝生物量为主要指标，对影响杏鲍菇生长的四个主要营养因子及最佳配方进行试验研究。

试验表明，液体培养杏鲍菇最佳碳源为玉米淀粉，最佳氮源为麦麸，最佳无机盐为KH2PO4，最佳维生素为复合VB。

液体培养杏鲍菇的最佳培养基配方为：

3%玉米淀粉、2%麦麸、0.1%KH2PO4、70μg/ml复合VB,起始PH为6～7。

用优选培养条件培养杏鲍菇菌丝，每100mL培养液平均可产干菌丝2.945g。

关键词:

杏鲍菇；深层发酵；培养基；优化

StudyontheMediumofSubmergedFermentationforPleorotuseryngii

Abstract：

Usingliquidculturemethodinthispaper,fourmainnutritionfactorswhichaffectthegrowthofPleorotuseryngiiwerestudiedaccordingtoindexofmyceliabiomass.TheresultsindicatedthattheoptimummediumforliquidcultureofPleorotuseryngiicontainedcornstarchascarbonsource,wheatbranasnitrogensource,KH2PO4asinorganicsaltandcomplexvitaminB.Theoptimummediumshouldbepreparedasfollows:

cornstarch3%,wheatbran2%,KH2PO40.1%,complexvitaminB70μg/mlandinitialPH6～7.Underaboveconditions,2.945gdrymyceliumofPleorotuseryngiiwasobtainedin100mlbroth.

Keywords：

Pleurotuseryngii;Submergedfermentation;Medium;Optimization

引言

杏鲍菇学名：

Pleurotuseryngii。

别名：

剌芹侧耳，在生物分类上属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属[1]。

杏鲍菇原产于欧洲南部，非洲北部，印度，巴基斯坦和中国新疆，四川西部等区域[2]。

杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，特别是菌柄组织致密、结实、乳白，可全部食用，且菌柄比菌盖更脆滑、爽口，被称为“平菇王”、“干贝菇”，具有愉快的杏仁香味和如鲍鱼的口感，适合保鲜、加工，深得人们的喜爱。

杏鲍菇营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、维生素及钙、镁、铜、锌等矿物质，可以提高人体免疫功能，对人体具有抗癌、降血脂、润肠胃以及美容等作用。

每100g杏鲍菇含有：

热量31.00千卡，碳水化合物8.30g，脂肪0.10g，蛋白质1.30g，在蛋白质中含有18种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸齐全，具有天然、营养、保健等多种特性与一体的珍稀食用菌，极受消费者欢迎[3,4]。

杏鲍菇的子实体单生或群生，菌盖宽2～12cm，初呈拱圆形，后逐渐平展，成熟时中央浅凹至漏斗形，表面有丝状光泽，平滑、干燥、细纤维状，幼时盖缘内卷，成熟后呈波浪状或深裂；菌肉白色，具有杏仁味，无乳汁分泌；菌褶延生，密集，略宽，乳白色，边缘及两侧平，有小菌褶；菌柄2～8cm至0.5～3cm，偏心生或侧生。

杏鲍菇属于中低温结实性菌类。

子实体发育适宜温度围10～15℃，通常采取室内菌袋层架栽培。

目前，杏鲍菇栽培普遍用的是固体菌种，固体菌种生产要经过较为繁琐的母种、原种、栽培种三级培育，存在劳动强度大、工艺繁琐、杂菌污染率高、生长周期长、菌龄不一致、规模化程度低等一系列问题，大大制约了杏鲍菇产业的发展[5,6]。

利用深层发酵生产的液体菌种具有菌龄整齐，生产周期短，菌种成本低等优点，且便于使用接种抢和自动接种机进行接种，简便快捷，利于管理，适宜规模化、工厂化生产[7～9]。

为此，对杏鲍菇液体发酵培养基进行再次研究，以确定其适宜的营养液配方，为液体菌种在食用菌生产中发挥更大作用，为扩大化生产提供科学的理论依据。

本试验着重研究的是不同配比的主要营养因子对杏鲍菇菌丝体产量的影响来确定最佳的培养基，因不同配比对菌丝体产量的影响很大，因此需要利用单因素试验首先筛选出最适合杏鲍菇菌丝体生长的主要营养因子：

碳源、氮源、无机盐和维生素。

然后，对液体培养杏鲍菇的这些最佳营养因子碳源、氮源、无机盐和维生素按不同配比进行正交试验，得出液体培养杏鲍菇的最佳培养基配方。

在此基础上确定培养基的最适起始pH,从而为杏鲍菇的扩大化生产做好基础准备。

第一章绪论

1.1食用菌生产状况

随着社会的进步，人们对营养价值的需求在不断的提高，因此，需要生产出大量的高品质，高营养的菇类来满足人们的需求，但是传统的固体培养杏鲍菇菌种的生产工艺比较繁琐，且费时费力，据统计，我国现有可食用的真菌有850多种,几乎包括目前世界上所报道的主要种类。

它以其特有的鲜香风味、丰富的营养和较高的药用价值得到世人的喜爱。

中国加入WTO，在充满机遇的同时意味着激烈的竞争。

近10年来，我国食用菌生产一直保持较高的增长速度，从1990年的100万t到1998年400万t[10],现在的产量约占世界总产量的2/3左右。

随着食用菌生产的迅猛发展，传统的食用菌生产模式已远远不能满足食用菌日益发展的要求。

因此，运用工业微生物的纯种培养技术来进行食用菌的工业化制种生产方法的研究，已经迫在眉睫。

1.2食用菌液体菌种的研究现状

食用菌的液体发酵在抗生素发酵技术的基础上发展起来的。

1947年美国的汉姆菲特首次提出了液体菌种法生产蘑菇菌丝体。

1958年，美国液体深层发酵专家J.Szuecs利用发酵罐成功培养出多种食用菌菌丝体。

1960年在日本，固体食用菌菌种称之为“第一时代菌种”一直被广泛使用。

直至1999年，日本一家大型菇厂首次采用了在可动发酵罐里培养食用菌菌种的韩国模式液体菌种系统，并称之为“第二时代菌种”。

国内从1960年上海植物生理研究所的陈聿美等对蘑菇的深层培养进行研究以来，已经有许多单位和个人对数十种食用菌进行了液体培养的研究[11]。

在中国第四届蘑菇节，日本起源生物技术株式会社的小林恭久先生着重介绍了还原型液体食用菌菌种，称之为“第三时代菌种”，它是把人工生产的还原型固体食用菌菌种块粉碎后用无菌水稀释而成的液体食用菌菌种，还原型固体菌种具有活力强，接种量大的特点，每1200ml菌种可扩接10000瓶。

目前，日本一些大型杏鲍菇食用菌菌种中心开始大规模地引进这一技术，并已经实用在杏鲍菇的生产上。

在国内，1962年中国科学院植物生理研究所的陈聿美等对香菇、杏鲍菇、平菇、草菇等15种食用菌的深层培养进行研究。

直至1987年，上海师范大学的杨庆尧等首次报道以液体食用菌菌种作为原种，合成颗粒或谷粒菌种作栽培种的蘑菇制种新工艺，整个制种工序历时仅23～27d，比旧工艺快3～4倍。

目前能用液体培养制种的食用菌有双孢蘑菇、金针菇、杏鲍菇、香菇、猴头菇、黑木耳、平菇等。

但由于液体食用菌菌种对生产工艺及技术条件要求高，多数试验停留在摇瓶培养阶段，并受资金和技术的限制，我国仍有相当多食用菌生产企业和个人采用传统固体菌种栽培模式。

2009年，黄爱荣等利用全自动发酵罐对双孢蘑菇As2796液体食用菌菌种的发酵工艺进行了研究，并对不同扩增倍数的液体食用菌菌种的活力进行了比较。

2010年，沈敏等对杏鲍菇液体食用菌菌种进行研发工作，并将液体食用菌菌种成功应用在工厂化栽培中，实现了杏鲍菇工厂化栽培的高产、优质、高效的目标。

随着工业化生产和经营管理方式组织食用菌生产的进程不断推进，越来越多食用菌生产企业将液体食用菌菌种生产技术与工厂化栽培技术有机结合，来实现食用菌规模化、标准化、现代化的工厂化生产。

1.3应用前景及方向

1.3.1食品工业上的应用

液体发酵食用菌菌丝体的营养成分，无论蛋白质、氨基酸，还是维生素的含量，都类似于子实体。

用工业化液体发酵生产食用菌蛋白质，比饲养家畜或家禽来获取蛋白质的时间短、效率高、成本低。

因此，食用菌的深层发酵在食品工业方面将有很大的发展前途。

1.3.2生物医药产业上的应用

食用菌在深层培养过程中会产生多糖、生物碱、萜类化合物、酶、核酸、具抗生素作用的多种化合物以及植物激素等多种生理活性物质，这些物质分别具有对心血管、肝脏、神经系统等人体器官的防病治病作用，以及抗癌、消炎和提高机体免疫力等功效。

1.3.3其它行业上的应用

液体发酵形成的菌丝体以及含有多种代谢产物的发酵液，是上等的饲料，一般作为蛋白质原料加入到饲料中，具有易吸收、转化效率高、经济效益好等特点，将是动物饲料中蛋白质的重要来源。

1.4杏鲍菇的研究状况

杏鲍菇含有丰富的钾、钙、钠、镁、锌、铜、铁、钼、锡等10余种矿质元素,18种氨基酸,其中含人体必需的8种氨基酸，入药有降血压、降血脂、降低胆固醇和增强肌体免疫力之功效。

其寡糖含量丰富,与双岐杆菌结合有改善肠胃功能和美容的效果,寡糖还有抗癌的活性作用[12]。

该菇肉质肥厚脆嫩,味道鲜美,有清淡的杏仁香味,风味独特,被誉为“菇中之王”。

但杏鲍菇属于低温型菌球,温度高于20℃以上,菇柄萎缩易发黄,甚至腐烂,易受细菌感染,商业性栽培规模尚小,生物转化率较低[13～15]。

采用液体深层发酵技术比传统的食用菌生产方式有明显的优越性,在短时间内能产生大量的菌丝体,菌种可进行工业化生产，具有生产周期短,菌龄整齐等优点[16,17]。

目前,国内外对真菌的研究主要集中于香菇、灵芝及虫草属等常见的名贵菌种,研究内容主要为多糖,利用其抗癌活性制备新药,或利用其子实体的提取制备保健饮料、口服液等。

法国、意大利和印度先后进行杏鲍菇人工栽培研究,泰国、日本和美国已进行小规模栽培试验。

我国20世纪90年代开始引种栽培。

目前国内外对杏鲍菇的研究仅限于固体培养[13,18],对液体深层发酵的研究却少见报道。

作者对杏鲍菇液体深层发酵工艺进行初步研究,旨在为杏鲍菇进一步开发提供科学依据。

液体深层发酵技术的概念是20世纪40年代提出的。

相比传统固体发酵方法,液体深层发酵技术有生产周期短、产率高、生产过程容易控制、产品质量稳定且提取分离容易的特点,因此在工业微生物和生物医药领域的应用范围和规模在不断扩大,对液体深层发酵技术条件的研究也越来越广泛和深入。

目前许多大型药用真菌的产品,如云芝糖肽（PSP）、PSK，灰树花多糖等，都已经运用该法进行工业化生产[19～22]。

目前,国内外对杏鲍菇的研究主要集中在其栽培技术上[23,24]。

从其生物学特性、子实体形成条件及培养料上进行探讨[25～27]。

传统上,人们多从人工栽培的子实体中开发活性物质,但由于人工栽培子实体生产周期长,劳动强度大,受季节与气候影响大,从而限制了杏鲍菇工业化生产。

且因水、空气、培养基质以及土壤等原因,造成重金属富集,致使提取后的生物活性物质缺乏安全保障。

而液体发酵可以进行工业化连续生产,具有接种方便、菌龄较一致、发酵周期短、规模大、产量高、生产效益高等优点。

用液体发酵培养获得的杏鲍菇菌丝体,其营养价值和有效成分完全与子实体相当,因此,液体深层发酵是开发杏鲍菇活性成分的有效手段[28]。

杏鲍菇产品的应用日益广泛，其需求量也不断增加，但是对生产条件的研究深度不足，对产品质量的标准化研究尚不足够,因此将限制杏鲍菇生产的进一步发展和完善，目前多数杏鲍菇生产还是仅限于固体培养培养菌丝体和子实体，液体深层发酵只是用于试验阶段，还没有进行大规模应用。

有待进一步优化生产条件，找出最优组合用于进行杏鲍菇菌丝体的培养，缩短生产周期，提高杏鲍菇菌丝体的产量。

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1杏鲍菇菌种

由河南农业大学食用菌研究所提供。

2.1.2培养基

（1）斜面菌种培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：

马铃薯200g，葡萄糖20g琼脂20g，水1000ml,PH值自然。

（2）液体菌种培养基：

玉米面30g，蔗糖20g，麦麸30g,酵母粉3g，MgSO40.5g，KH2PO41g,水1000ml,PH值自然。

2.1.3试验原材料

碳源：

甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米淀粉。

氮源：

硝酸钠、尿素、麦麸、蛋白胨、黄豆粉。

无机盐：

MgSO4，Ca2Cl，KH2PO4，KCL,FeSO4。

维生素：

VB1、VB2、VB6等各种原料。

2.1.4仪器设备

恒温培养箱、旋转式摇瓶机、高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平等。

2.2试验方法

2.2.1母种活化

将保存的菌种转接到无菌的斜面培养基上，放入25℃左右的恒温培养箱中，培养6～9d，得到斜面母种。

2.2.2一级摇瓶菌种

将活化的斜面母种分割成1cm2大小的快，接种到液体摇瓶培养基中，每瓶3块，置于培养箱内，25℃静置培养24h后，置于25℃的摇床上震荡培养6d，获得一级摇瓶菌种。

2.2.3摇瓶发酵培养

按照各处理要求，制作液体培养基，然后接入一级菌种，用250ml的三角瓶，装液量为100ml每瓶，在摇床上振荡培养6d。

2.2.4试验设计

2.2.4.1碳源单因素试验

基本培养基为：

3%麦麸，HK2PO40.15%，60μg/mlVB1，60μg/mlVB2，60μg/mlVB6。

分别添加甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米淀粉作为碳源，浓度均为3%，每个因素重复3次[29]。

2.2.4.2氮源单因素试验

基本培养基为：

2%玉米淀粉，HK2PO40.15%，60μg/mlVB1，60μg/mlVB2，60μg/mlVB6。

分别添加硝酸钠、尿素、麦麸、蛋白胨、黄豆粉作为氮源，浓度均为3%，每个因素重复3次[29]。

2.2.4.3无机盐单因素试验

基本培养基为：

2%玉米淀粉，3%麦麸，60μg/mlVB1，60μg/mlVB2，60μg/mlVB6，分别添加MgSO4，Ca2Cl，KH2PO4，KCL，FeSO4作为无机盐，浓度均为0.15%，每个因素重复3次[29]。

2.2.4.4生长因子单因素试验

基本培养基为：

2%玉米淀粉，3%麦麸，KH2PO40.15%，分别添加60μg/mlVB1、60μg/mlVB2、60μg/mlVB6、60μg/mlVB1+60μg/mlVB2、60μg/mlVB1+60μg/mlVB6、60μg/mlVB2+60μg/mlVB6、60μg/mlVB1+60μg/mlVB2+60μg/mlVB6作为生长因子，设置三个重复[29]。

2.2.5不同配比的营养因子对杏鲍菇菌丝体生长的影响

设计L9（34）的正交试验，通过测定菌丝体干重来确定影响杏鲍菇生长的最佳碳源、氮源、无机盐、生长因子的配比。

试验前采用PDA培养基将供试的杏鲍菇复壮,扩大培养。

将斜面菌种接种到液体培养基中，250ml锥形瓶装液量100ml置转速120r.min，温度25℃的往复式摇床上振荡培养7d，得到一级种，并按10%接种量进行扩培。

然后按10%接种量将其接种到不同的供试培养基中,每个处理3次，于相同条件下培养7d,正交试验因素水平见表2.1.

表2.1培养基营养因子正交试验因素与水平

水平

因素

A玉米淀粉/%B麦麸/%CKH2PO4/%DVB1+VB2+VB6μg/ml

1110.1050+50+50

2220.1560+60+60

3330.2070+70+70

2.2.6液体培养基最适pH试验

采用上述试验确定的最适培养基配方，用1mol/LHCL或1mol/LNaOH将培养基pH分别调整为4、5、6、7、8、9，接种后，利用上述试验确定的最佳培养条件进行震荡培养6d。

测定在不同起始pH条件下pH的变化情况，通过测定菌丝体的含量来确定培养杏鲍菇液体培养基的最适起始pH[30]。

2.2.7称量菌丝体的干重

将培养好的菌丝体用离心机先进行离心沉淀，再用滤纸过滤，然后用蒸馏水冲洗几遍，放在已烘干与称重的培养皿上，放入干燥箱中105℃烘干，再称重，直至2次称重的重量差不超过2mg即为恒重。

第三章试验结果与分析

3.1碳源单因素试验结果

由表3.1知，当玉米淀粉作为碳源时，菌丝生长量最大，每100ml培养液最高可产干菌丝2.670g（平均为2.518g），其次为可溶性淀粉，菌丝量最少的是甘露醇，每100ml培养液最高可产干菌丝0.414g（平均为0.436g）；从整体角度来看，混合物碳源要比化合物碳源的产量高，从表中可看出，可溶性淀粉和玉米淀粉的菌丝产量明显的比甘露醇、麦芽糖和葡萄糖的产量高。

这是因为混合物碳源里面含有多种营养物质供菌丝体生长利用，如玉米淀粉中含有糖类、蛋白质、胡萝卜素、黄体素、天然维生素E，玉米黄质、磷、镁、钾、锌等。

其中天然维生素E，有促进细胞分裂，延缓细胞衰老的功能。

因此，玉米淀粉是最佳碳源。

碳源既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，也是提供菌体生命活动所需的能源，对发酵有着重要影响[31]。

淀粉类多糖一般需经过菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被利用，可克服葡萄糖等单糖代谢过快的弊端。

对于杏鲍菇之类的大型真菌，培养周期较长，多糖类的碳源应优于单糖，但是浓度不能太高或太低，如淀粉浓度过高，造成发酵液黏度过大，溶氧降低，会影响菌丝生长；浓度过低，会造成营养不足，使菌丝衰老甚至自溶。

表3.1碳源单因素试验结果（g/100ml）

项目甘露醇麦芽糖葡萄糖可溶性淀粉玉米淀粉

0.4200.5301.4382.2052.560

菌丝干重0.4750.4711.3422.0102.324

0.4140.5131.2721.9652.670

平均值0.4360.5051.3512.0602.518

3.2氮源单因素试验结果

由表3.2可知，当麦麸作为氮源时，杏鲍菇菌丝生长量最大，每100ml培养液最高可产干菌丝2.830g（平均为2.615g），其次为蛋白胨，较差的为尿素和硝酸钠。

从整体角度来看，有机氮源比无机氮源的菌丝产量要高。

氮源作为培养基的重要营养成分，主要功能是构成微生物细胞和含氮代谢物[32]。

由于蛋白胨、麸皮、黄豆粉里既有碳元素又有氮元素，也含有其它的营养物质，有利于杏鲍菇菌丝体生长发育，营养物质较丰富，菌丝生长较快。

而杏鲍菇在无机氮源上基本生长很慢，证明杏鲍菇利用无机氮源的能力较差，这是因为有些氨基酸杏鲍菇自身不能合成，无机氮源是不能提供的，只能吸收有机氮源内的游离氨基酸。

表3.2氮源单因素试验结果（g/100ml）

项目硝酸钠尿素麦麸蛋白胨黄豆粉

0.0620.0402.5602.0501.806

菌丝干重0.0800.0352.8302.4542.030

0.0730.0542.4552.3672.255

平均值0.0720.0432.6152.2902.030

3.3无机盐单因素试验结果

由表3.3可知，当KH2PO4作为无机盐材料时，KH2PO4最好，杏鲍菇的菌丝生长量最多，每100ml培养液最高可产干菌丝2.860g（平均为2.733g）其次为CaCL2最差的是FeSO4。

钾离子不仅能调节细胞渗透压和通透性，还能激活许多酶，并促进糖代谢。

表3.3无机盐单因素试验结果

（g/100ml）

项目MgSO4Ca2ClKH2PO4KCLFeSO4

1.5202.3202.8602.3401.560

菌丝干重2.1542.3872.5432.2001.679

2.2342.5642.7961.9981.898

平均值1.9692.4242.7332.1791.712

3.4生长因子单因素试验结果

由表3.4可知，把生长因子结合起来使用要比生长因子单独使用时产量高，复合生长因子VB1+VB2+VB6作为培养液原料时，菌丝量达到最大，每100ml培养液最高可产干菌丝2.890g（平均为2.775）这说明当三种生长因子复合使用效果最佳。

因