微生物基本操作规范.docx

微生物基本操作规范.docx

《微生物基本操作规范.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物基本操作规范.docx（23页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

微生物基本操作规范

培养基得制备

培养基概念:

就是指以液体、半固体或固体形式,包含天然或合成成分，用于促进微生物得繁殖或保持其活力得物质组成。

由于各类微生物对营养得要求不同,培养目得与检测需要不同,因而培养基得种类很多。

我们可根据某种标准，将种类繁多得培养基划分为若干类型.　

培养基得分类：

按功能分类：

基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基.

按物理性状分类：

液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

液体培养基:

所配制得培养基就是液态得,这种培养基被用来微生物得增菌与生长状态观察。

固体培养基与半固体培养基:

在液体培养基中加入适量得凝固剂制成成固体培养基与半固体培养基。

常用作凝固剂得物质有琼脂.固体培养基琼脂用量1、5－2％,半固体培养基琼脂用量在０、5~1％之间.固体培养基用作微生物得分离、鉴定、计数、保藏等.半固体培养基被用来观察微生物得动力与保藏菌种。

今天给大家展示一下各种培养基得制备。

培养基制备得基本过程：

ﻫ调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查与保存

所需物品：

试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。

（1）调配成分：

在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml,１％蛋白胨,0、5％NaＣL,0、3%牛肉膏（g/v）,准确称取各种成分，使其充分混合.

［注意事项］

培养基调配溶解:

先在锥形瓶底加入少量得蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。

制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅,搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁与铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过0、１4mg/L时抑制细菌毒素得产生，含铜量超过0、3mｇ/L时抑制细菌得生长）。

培养基中若需加入染料，胆盐，指示剂等,应在校正pH后加入。

（2）溶解：

将配制好得混合物微波炉加热8min，使其完全溶解,补足失水。

（3）校正PＨ：

ﻫ不同得细菌需要在含不同ｐＨ培养基上生长,一般将培养基得ｐH调至7、２～7、6。

商品化得试剂配制后可省略该步骤，无需校正PH。

根据所需得培养基用途不同分别加入不同含量得琼脂，制成半固体培养基与固体培养基.

（4）分装:

（液体培养基、半固体培养基与部分固体培养基得分装可在灭菌钱也可在灭菌后）

①基础培养基:

一般分装于容量为500ml锥形瓶灭菌后备用,以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；

②琼脂斜面：

通常在融化后分装于试管,量约为试管高度得1／４～1/3，灭菌后倾斜放置.

③半固体培养基:

分装量为试管容量得１/4～1/３，灭菌后直立放置。

④液体培养基：

分装量为管长得1/５，灭菌后直立放置。

（5）灭菌:

分装好得培养基常用高压蒸气灭菌，条件为103、4３kＰａ,温度1２1℃1５~2０ｍｉn；含糖培养基以68、95kＰa，１0～15min为宜,以免破坏糖类物质；不耐高热得物质配制成得培养基,常用流通蒸气灭菌或滤过除菌。

琼脂平板制备：

先将灭菌琼脂融化后冷却至５0℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径75mｍ得平皿约8—９ｍｌ）,水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置４℃保存备用。

营养平板制备:

先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作加入１0％无菌得脱纤维羊血（临用前置３7℃水浴预温30mｉn），轻轻摇匀（避免产生气泡）,倾注于灭菌平皿内（内径75mm得平皿约８—9ml），水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转,置4℃保存备用。

[注意事项]

平板得浇注：

倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物得落入。

倾注时若培养基温度过高,则冷凝水过多,易致污染，不易分离到菌落；若温度过低,部分琼脂凝固,倾注平板表面高低不平。

可在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝,这样利于蒸气散发,减少平板内冷凝水。

倾注血液琼脂时,由于加血时琼脂表面容易产生气泡,倾注时适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面得气泡。

（6）质量检查：

ﻫ需做无菌试验与效果试验。

　①无菌试验:

将灭菌后得培养基置3７℃孵育２4h,无任何微生物生长为合格。

ﻫ②效果试验:

将已知得标准参考菌株接种于待检得培养基中，检查细菌得生长繁殖状况与生化反应就是否与预期得结果相符与。

（7）保存：

经过质量检查合格得培养基注明名称，制作日期存放于冷暗处或４℃冰箱（固体培养基应将平皿得底朝上,盖朝下或用保鲜袋包裹，以减少水分蒸发,液体培养基应直立放置，以免污染）。

微生物得分离培养与接种技术

接种：

将微生物接到适于它生长繁殖得人工培养基上或活得生物体内得过程叫做接种。

将微生物混与培养物通过一定得接种技术接种到人工培养基中得到纯培养得过程称为分离纯化。

今天给大家展示一下各种培养基得分离培养得接种技术与细菌得生长状态。

1、接种所需物品：

接种工具（接种环、接种针等）、酒精灯、待接种菌种.接种环用于固体与液体培养基得接种,接种针用于固体培养基与半固体培养基得接种。

接种技术要求：

用灭菌得工具（如接种针与吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于灭菌培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

接种工具得灭菌方法：

通常接种环或接种针在火焰上外焰灭菌。

灭菌后得接种工具在接种微生物前需先冷却，可接触一下培养基,待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体,迅速地接种到新得培养基上.接种后将接种工具再次灭菌才可放置。

２、接种环境:

为避免接种过程中标本中得微生物污染环境及空气中得微生物污染培养物，微生物得接种应在特定环境内接种。

常用得设备有接种罩、超净工作台或无菌室等.

3、接种方法：

根据待检标本性质、培养目得与所用培养基得性质采用不同得接种方法。

（1）平板划线分离培养法：

通过平板划线分离培养使混合细菌培养物在培养基表面分散生长,各自形成菌落,根据菌落得形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）.平板划线分离培养法常用来分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。

根据划线得方式不同有连续划线分离法、分区划线分离法、棋盘划线分离法等.

a、连续环线分离法:

先将接种环火焰灭菌，待冷后取培养物少许.左手拿起平板,并用拇指与食指将平板盖打开，右手迅速将取有培养物得接种环从打开得空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45℃角，先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种,线与线间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线.注明标识后,置35℃培养箱中培养,一般在18～２４小时后观察结果。

b、分区划线分离法：

用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、３……区依次划线。

每划完一个区域,均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。

每一区域得划线均接触上一区域得接种线1~２次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。

其她操作与上述曲线划线分离法相同。

c、棋盘格线划线分离法:

将培养物涂布于平板上1／５处,接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条，将接种环灭菌后,划垂直线5～6条，使呈正方形格。

其她操作同前.

（2）斜面接种培养法:

主要用于纯菌移种,以进一步鉴定或保存菌种.接种方法就是以灭菌得接种环挑取细菌后伸入斜面培养基管，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。

取出接种环,火焰灭菌管口,加塞;最后将接种环经火焰灭菌放好。

做好标识，置35℃培养箱中培养18～2４小时.

（3）液体接种法：

主要用于微生物得增菌与生长状态观察.接种方法就是以灭菌得接种环挑取细菌后伸入培养基管中,在接近液面得管壁上方轻轻研磨,并沾取少许培养基液体调与，使细菌混合于培养基得液体中.取出接种环,火焰灭菌管口,加塞；最后将接种环经火焰灭菌放好.做好标识，置３5℃培养箱中培养1８~24小时。

（４）半固体培养基穿刺接种法:

多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌得某些生化反应.以灭菌接种针挑取细菌后,垂直刺入培养基得中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出.

细菌得生长现象

细菌在不同得培养基上接种后，在一定得培养条件下（通常为３5℃培养箱中培养18～２4小时），可表现不同得生长现象。

（1）固体培养基：

细菌在固体培养上生长后可表现出2种生长情况：

菌落与菌苔。

菌落:

单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见得细菌集团。

菌苔：

多个细菌分类繁殖后形成密集一片得细菌集团。

（2）液体培养基:

细菌在液体培养基中生长后可表现３种生长情况:

表面生长、均匀浑浊、沉淀生长。

（3）半固体培养基：

细菌在液体培养基中生长后可表现２种生长情况:

沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长与沿穿刺线呈线性生长。

常用染色液配制

实验室观察微生物得形态结构主要通过一定得染色方法后在显微镜下，常用得染色方法有革兰染色、抗酸染色等.

革兰染色液配制

（1）结晶紫染液：

称取结晶紫4～8g,溶于1０0ｍl95%乙醇中制成饱与液。

取20ml饱与液与8０mｌ10ｇ／L草酸钾溶液混合即成，用滤纸过滤备用。

（2）卢氏碘液：

ﻫ先将2g碘化钾溶于10ｍl蒸馏水中,再加1g碘，待碘全部溶解后再加蒸馏水至3０0ｍl即成。

（3）95％乙醇或丙醇乙醇溶液（95％乙醇70ml＋丙醇30ｍｌ）

（4）稀释石炭酸复红液：

ﻫ称取４g碱性复红溶解于10０mｌ　95％乙醇，即成碱性复红乙醇饱与液，吸取1０ｍl饱与液与９0mｌ５0ｍgL石炭酸水溶液，混匀,即成石炭酸复红饱与液，再量取10ｍl石炭酸复红饱与液加90ml蒸馏水混匀即成。

抗酸染色液配制

（1）石炭酸复红液：

碱性复红8g溶于１０0ml95％乙醇制备成碱性复红饱与液,取１0ml饱与液与９０ｍl5%石炭酸水溶液混匀。

（２）盐酸酒精:

5%盐酸乙醇液（5ｍl浓盐酸+95mｌ９５%乙醇），使用时10倍稀释即可。

（3）亚甲兰液:

0．３g亚甲蓝+5０ml95%乙醇，待溶后，加蒸馏水10０ml,混匀,使用时10倍稀释.

细菌涂片制作、染色观察与细菌基本形态观察

所需物品：

细菌培养物、革兰染色液、细菌接种工具、载玻片、生理盐水、光学显微镜。

1、细菌涂片标本得制作

细菌进行染色检查前首先要制备细菌涂片,制作细菌涂片一般包括涂片、干燥、固定三步。

（1）涂片:

用灭菌得接种环挑取1—2环生理盐水涂于洁净得载玻片上,将接种环灭菌后挑取固体培养基上细菌培养物少许于生理盐水中磨匀，呈轻度混浊.涂好菌膜大小一般以1cｍ2左右为宜。

注意事项：

1）细菌涂片制作每次挑取细菌培养物前后都要注意无菌操作。

2）若就是细菌培养物在液体培养基（如肉汤、浓汁、痰液、咽拭子）中，可用灭菌接种环直接挑取１-2环液体培养物涂布于洁净得载玻片上，不需要另外添加生理盐水.

3）若多个标本同时进行同样染色,可用蜡笔在玻片上画出数格,做好标记再分别涂片,以免混淆。

4）用火焰烧灼沾有菌液得接种环时，为防止菌液受热溅散污染环境,接种环灭菌前,须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干,然后再在外焰中烧红灭菌,杀死残留得细菌。

（2）干燥:

涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰半尺高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干.

（3）固定:

细菌得固定常用火焰加热法,即将上述已干得涂片在酒精灯火焰中通过3次。

固定得目得在于杀死细菌，并使细菌菌体与玻片粘附牢固，染色时不致于被染液与水冲掉,同时固定可凝固细胞质，改变细菌对染料得通透性。

2、革兰染色法

（1）原理:

1）革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易透入，不易被脱色;而革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易透入,易被脱色。

2）革兰阳性菌等电点叫阴性菌低（PI2-3、ＰI４-5）,在相同条件下，革兰阳性菌所带负电荷较阴性菌多，与带正电荷得染料（结晶紫）结合较牢固且不易脱色。

3）革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫与碘牢固地结合成大分子复合物,不被乙醇脱色;而革兰阴性菌细胞内含有极少量得核糖核酸镁盐,吸附染料量少,形成得复合物分子也较少，易被乙醇脱色。

（2）方法:

1）初染:

将结晶紫染液加于制好得涂片得菌膜上,染色1ｍin,用细水流冲洗，甩去积水。

2）煤染:

加卢戈碘液作用１miｎ,用细水流冲洗，甩去积水.

3）脱色：

滴加９５％乙醇数滴,摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直至流下酒精无色为止（约0、5min），用细水流冲洗，甩去积水。

4）复染:

加稀释石炭酸复红染0、５ｍiｎ,用细水流冲洗，甩去积水，用吸水纸吸干后，在涂片菌膜上滴加香柏油，置油镜下检查。

注意事项:

操作因素：

涂片太厚或太薄,固定菌体过分受热或脱色时间长短,染液冲洗方法不同，都会影响染色结果.

细菌因素：

细菌得菌龄不同,染色结果也有所差异。

染液因素:

所有染液应防止染液蒸发而改变浓度,特别就是卢戈碘液久存或受光作用后易失去煤染作用,涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果。

抗酸染色法

1、细菌制片：

同革兰染色（但需厚涂片）。

２、抗酸染色

初染:

将固定好得涂片置于染色架上，滴加饱与石炭酸复红染液，并于载玻片下方以弱火加热至出现蒸汽（勿煮沸或煮干）随时补充染液以防止干枯,持续5min，水洗。

脱色:

3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红色染液脱下为止，然后水洗。

复染：

美蓝染液复染1miｎ，水洗,印干（印干用得滤纸只能使用一次，以防止假阳性）.印干后，在涂片菌膜上滴加香柏油,置油镜下检查.

3、细菌基本形态观察

革兰染色后得细菌涂片可在普通光学显微镜得油镜下观察细菌具体形态。

普通光学显微镜由光学方法系统与机械装置两部分组成，光学放大系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等,机械装置一般包括底座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒等。

普通光学显微镜油镜使用方法

普通光学显微镜得接物镜一般有3种，即低倍镜、高倍镜与油镜。

检查微生物形态时常用得就是油镜。

油镜得标志就是:

①透镜直径最小;②油镜长度大于低倍镜与高倍镜；③油镜头得下缘有一圈黑线或白线④有放大倍数1０0X得标记。

当接目镜倍数为10X,接物镜用油镜时，显微镜放大倍数为1000倍,可观察到细菌得形态。

油镜观察得原理：

油镜得透镜很小，自标本片透过得光线，因玻片与空气介质密度不同,而使部分光线经载玻片与空气折射后而不能进入接物镜,致使射入光线较少,物象不清晰。

在油镜与标本之间滴加与玻璃折光率相近得香柏油,则使进入油镜得光线增多，视野光亮度增强,物象清晰。

1）显微镜在使用时应平放在实验台适宜得位置.用油镜时，勿使镜臂与载物台倾斜,以免镜油流出,影响观察.

2）油镜检查染色标本时,光线宜强，可将聚光器上升到最高位置,将光圈全部打开，以获得最佳光度。

3）将染色后待检查得标本置于载物台上，用标本推进器固定,将待检标本得菌膜移于接物镜下。

4）标本欲检部位滴一滴香柏油,然后转换成油镜,缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动。

观察接物镜，缓慢调节粗调节器，使镜筒上升（不能下降,以免压碎标本片与损伤油镜），待瞧到模糊物象使,再调节细调节器，直至清晰瞧到细菌。

调节过程中若油镜末端已离开油面,应按上述过程重复操作.

5）观察标本时应两眼同时睁开,以减少眼睛疲劳，同时调节两个目镜之间得距离直至获得最佳视觉效果。

注意事项

1）显微镜就是精密得光学仪器，使用时应注意爱护,各部分结构不得随意拆卸，以免损坏.

2）取送搬移显微镜时，要一手持镜臂，一手托镜底,平端在胸前，轻拿轻放。

3）避免强酸、强碱、氯仿、乙醇、乙醚等化学药品与显微镜接触。

显微镜光学部分必须保持清洁,避免阳关直接照射。

细调节器就是显微镜精细而脆弱得部分,不要向同一方向连续转动数周,应轻微地来回旋转。

4）镜头必须保持清洁,只能用软且无毛得擦镜纸擦拭.油镜使用后应立即用擦镜纸拭去镜油,若油镜头得油迹未擦干净,应先将二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头,再用干净擦镜纸擦去镜头上残留得二甲苯。

5）显微镜擦净后,接物镜转成“品”字形，下降聚光器,套上显微镜套，放入实验柜中。

细菌得基本形态观察

经革兰染色后油镜观察:

细菌染色可分为两种：

革兰阳性（紫色）、革兰阴性（红色）;细菌形态可分为3种:

球形、杆形、螺形.

经抗酸染色后油镜观察：

在淡蓝色背景下可见染成红色细长或略带弯曲得杆菌，并有分枝生长趋向,此为抗酸染色阳性菌。

其她细菌与细胞均被染成蓝色。

细菌得生化反应

不同得细菌具有不同得酶系统,对底物得分解能力及代谢产物都不同.这些代谢产物具有不同得生物化学特性，可利用生物化学得方法测定这些代谢产物以鉴定细菌,称为细菌得生化反应。

生化反应得分类：

1、碳水化合物得代谢试验（糖、苷、醇类发酵试验；氧化－发酵试验；七叶苷水解试验;甲基红试验；V-P试验）2、蛋白质与氨基酸得代谢试验（吲哚试验；硫化氢试验；尿素分解试验；苯丙氨酸脱羧酶试验；氨基酸脱羧试验）3、碳源与氮源利用试验（枸橼酸盐利用试验）4、细菌酶试验（凝固酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、CAMP试验、胆汁溶菌试验）5、抑菌试验（杆菌肽试验、0/１２9试验）。

今天示教一下细菌常见得生化反应接种方法与结果。

1、糖发酵试验

组成：

培养基＋糖（苷、醇）+指示剂（溴甲酚紫）

原理：

各种细菌含有不同得分解糖（苷、醇）得酶,对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有得不分解，有得分解仅产酸,有得分解产酸又产气，故可用来鉴别细菌。

方法：

将待检菌接种糖发酵管（液体培养基接种法）,3５℃培养箱中培养18~2４小时,观察结果。

结果:

见示教管。

2、甲基红试验

组成：

葡萄糖蛋白胨水培养基+指示剂（甲基红）

原理:

某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基PH在4、５以下，加入甲基红试剂呈红色（阳性）。

某些细菌分解葡萄糖产生得酸进一步转化为醇、酮等非酸性物质，使培养基PH在６、2以上,加入甲基红试剂呈黄色（阴性）。

方法:

将待检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法）,3５℃培养箱中培养18~24小时，加入甲基红指示剂2－３d,立即观察结果.

结果：

见示教管.

３、Ｖ－P试验

组成：

葡萄糖蛋白胨水培养基+NaＯH+α-萘酚—乙醇

原理：

某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰,后者与蛋白胨中得精氨酸所含得胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为Ｖ—Ｐ试验阳性。

不变红色为阴性。

方法：

将待检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法），35℃培养箱中培养２4~48小时，加入V－P试验甲液与乙液各１ｄ,立即观察结果（红色为阳性、不变色为阴性）.

结果：

见示教管.

４、吲哚试验（靛基质试验）

组成：

蛋白胨水培养基+吲哚试剂。

原理：

细菌具有色氨酸酶,分解蛋白胨水中得色氨酸产生吲哚,与吲哚试剂形成红色化合物。

方法：

将待检菌接种到蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法），3５℃培养箱中培养18－24小时，加入吲哚试剂数滴,静置半分钟，观察结果（培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性,不变色者为阴性）.

结果：

见示教管。

５、苯丙氨酸脱氨酶试验

组成：

苯丙氨酸培养基＋三氯化铁。

原理:

某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸,加入三氯化铁试剂螯合成绿色化合物.

方法:

将待检菌接种到苯丙氨酸培养基中（液体培养基接种法），35℃培养箱中培养1８－2４小时,加入三氯化铁试剂,观察结果（绿色为阳性，不变色为阴性）。

结果：

见示教管。

6、尿素酶试验

组成:

尿素培养基+指示剂（酚红）。

原理：

具有尿素酶得细菌能分解尿素产氨，使培养基呈碱性,酚红指示剂变红色.

方法：

将待检菌接种到尿素培养基中（半固体培养基接种法），３５℃培养箱中培养18—２４小时,观察结果（培养基变红为阳性,反之为阴性）。

结果:

见示教管。

７、枸橼酸盐利用试验

组成：

枸橼酸盐＋指示剂（溴麝香草酚蓝）

原理：

当细菌可以利用铵盐作为唯一得氮源，同时利用枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐,使培养基产碱,指示剂溴麝香草酚蓝变色。

方法：

将将待检菌接种到尿素培养基中（半固体培养基接种法）,35℃培养箱中培养18—２4小时，观察结果（培养基由绿色变成蓝色，则为阳性，不变色则为阴性）。

结果:

见示教管.

８、氧化发酵（O/F）试验

组成：

无氧得葡萄糖发酵管。

原理:

根据细菌在有氧与无氧情况下对葡萄糖代谢情况,确定细菌得代谢类型。

O型（有氧情况下分解糖），F型（有氧与无氧情况下分解糖），Ｋ型（无氧与有氧情况下均不分解糖）.

方法：

取2支含葡萄糖培养管，置沸水中，驱除培养基中得氧气.冷却后，2只培养管均接种待检菌，１管加灭菌石蜡置于培养基上层隔绝空气,１管不加石蜡，３5℃培养箱中培养１８—2４小时,观察细菌在有氧与无氧情况下对葡萄糖分解能力。

结果:

见示教管.

9、硝酸盐还原试验

组成：

硝酸盐培养基+醋酸+对氨基苯磺酸+α—萘胺.

原理:

某些细菌还原硝酸盐生成亚硝酸盐，与醋酸生成亚硝酸,与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，加入α—萘胺生成偶氮苯磺酸，形成红色化合物。

方法：

将待检菌接种到硝酸盐培养基中,35℃培养箱中培养18-24小时，加入硝还试验甲与乙试剂,观察结果（红色为阳性，不变红为阴性）.

结果：

见示教管。

注意事项：

本试验阴性结果可能有两种情况：

真阴性与假阴性，通常要用Zn粉还原试验验证就是否就是假阴性。

10、氧化酶试验

组成：

氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）。

原理:

细菌具有氧化酶,可与氧化酶试驾反应生成红色化合物.

方法:

用滤纸条沾取待检菌,吸管滴加氧化酶试剂，变红色为阳性，不变色为阴性。

结果:

见操作.

11、触酶试验

组成：

触酶试剂（H２Ｏ2）。

原理：

细菌具有触酶（过氧化氢酶）,能分解Ｈ２Ｏ2，产生氧分子,出现气泡。

方法:

挑取待检菌培养物于洁净玻片上，滴加3%　H2O２数滴，观察结果，出现气泡为阳性，不出现气泡为阴性。

结果:

见操作。

12、凝固酶试验

组成：

新鲜抗凝血浆。

原理：

金黄色葡萄球菌具有游离型凝固酶,可使新鲜抗凝血浆重新发生凝固.

方法：

将待检菌接种到1：

4稀释得新鲜抗凝血浆，置３7℃水浴3—4h，观察结果，血浆凝固为阳性,不凝固为阴性。

结果:

见示教管。

13、KIA复合试验（克氏双糖铁）

组成:

培养基＋底物[乳糖、葡萄糖（1/１0）、酚红、硫代硫酸钠、FeSO4］。

原理:

该培养基使用酚红作为指示剂,酸性呈黄色，碱性呈红色。

细菌若能发酵乳糖与葡萄糖产酸产气,则斜面与底层呈黄色，且有气泡.若只发酵葡萄糖不发酵乳糖,则斜面呈红色，底层呈黄色。

若分解硫代硫酸钠产生硫化氢与铁生成黑色硫化铁，培养基变黑.

方法：

将待检菌接种ＫIA培养基（固体斜面培养基接种法），35℃培养箱中培养18～２4小时,观察结果。

结果:

见示教管.

１4、MIU复合试验

组成：

半固体培养基+底物[色氨酸、尿素、酚红］

原理:

细菌具有脲酶可分解尿素产碱酚红变色；细菌具有色氨酸酶分解色氨酸产生吲哚,加入吲哚试剂培养基变红,有动力得细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长）。

方法:

将待检菌接种MIU培养基（穿刺接种）,35℃培养箱中培养１8~24小时,观察动力与脲酶反应后,再滴加吲哚试剂。

结果：

见示教管.

消毒灭菌

消毒灭菌即就是用物理或化学方法来抑制或杀死外环境中及机体体表得微生物，以防止微生物污染或病原微生物传播得方法。

实验室常用消毒灭菌方法主要为:

紫外线杀菌与高压蒸汽灭菌.

１、紫外线杀菌试验

原理:

波长2４0-30０nm得紫外线具有杀菌作用,其中以波长2６6ｎn紫外线杀菌作用最强.紫外线作用生物细胞得DNA,使DNA链上两个相邻得T以共价键结合