生物药物综合实验----植物原生质体的制备.ppt

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生物药物综合实验,王维彬,实验八,植物原生质体的制备,实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题,学习用酶溶解细胞壁的方法制备原生质体，为细胞生理研究提供必要基础。

掌握植物原生质体分离的基本原理及其操作过程,实验目的,植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质，可通过混合酶液消化细胞壁而获得。

原生质体经适宜的培养能合成新壁，并进行细胞分裂，经特殊诱导可生成完整植株。

除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

实验原理,材料：

油菜或菠菜或烟草叶片试剂：

（1）酶混合液1纤维素酶1果胶酶0.7mol/L甘露醇0.7mmol/LKH2PO410mmol/LCaCl22H2OpH6.87.0,实验器材,

（2）12%甘露醇（3）0.16mol/LCaCl2（4）20%蔗糖液仪器：

离心机、显微镜等,1.材料称取与质壁分离称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水冲洗4-5次。

加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用,实验方法,2.酶解将切碎的材料放入到培养皿中，取酶混合液5ml到培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液。

黑暗下酶解1.5小时，中间轻晃几次。

3.原生质体的收集与纯化

（1）将酶-原生质体混合液收集于10mL刻度离心管中，盖盖，600800r/min离心7min，使原生质体沉降。

（2）去上清液，留沉淀即收集的原生质体。

向离心管中缓缓加入0.16mol/L氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀，使沉淀悬浮。

（3）用注射器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖液约23mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。

（4）以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。

4、原生质体的观察用吸管取一滴纯化好的原生质体放在载玻片上，用吸水纸将多余液体吸干，置显微镜下进行观察。

实验结果,1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。

但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。

所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。

因此，取材成为实验成功与否的首要问题。

2、在离心过程中一定要注意转速。

注意事项,1、简述植物原生质体制备的方法步骤；2、按镜下观察绘制原生质体。

思考题名,