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ELISA毕业论文

目录

1.双酚A（BisphenolA，BPA）概况2

1.1双酚A简介2

1.2.双酚A使用现状2

1.3.双酚A残留分布3

1.4.双酚A的残留危害性3

1.5.双酚A的降解3

1.6.双酚A的检测方法3

1.7.双酚A（BPA）免疫分析依据4

2.材料与方法5

2.1.实验材料5

2.2.实验方法6

2.2.1合成路线6

2.2.2双酚A抗原的合成与鉴定7

2.2.3抗体的制备和纯化9

2.2.4抗体效价测定及工作浓度的选择10

2.2.5标准曲线的建立11

2.2.6水中的添加回收试验11

3.结果与分析11

3.1.抗体工作浓度的选择11

3.2.标准曲线的建立12

3.3.样品添加回收率的测定12

4.讨论12

4.1.抗原的合成12

4.2.包被原的制备13

4.3.pH值对抗原抗体结合反应的影响13

4.4.有机溶剂对抗原抗体结合反应及BPA抑制的影响13

4.5.样品中双酚A的ic-ELISA分析14

1.双酚A（BisphenolA，BPA）概况

1.1双酚A简介

1.1.1物理性质双酚A学名2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，简称双酚基丙烷，英文名称BisphenolA（BPA）。

白色晶体，可燃，微带苯酚气味。

沸点250~252oC（1.773kPa）。

纯品熔点155-156oC，工业熔点150-152oC。

相对密度1.195（25oC），闪点79.4oC。

溶于乙醇、丙酮、乙醚、苯及稀碱液等，微溶于四氯化碳，几乎不溶于水。

其结构式见下图：

1.1.2化学性质双酚A分子中因存在苯环和酚型羟基，故与苯酚性质有些相似，呈弱酸性，易与稀碱溶液作用而生成相应的金属盐。

长期曝露于空气中会被氧化，颜色逐渐变黄甚至泛红。

在高温或酸碱作用下，易分解生成苯酚和对异丙烯基苯酚。

经基邻位上的氢较活泼，易被卤化、磺化、硝化、烃化、羟化等；在碱性介质中可与甲醛缩合，生成甲阶酚醛树脂；在酸性介质中可与丙酮缩合，生成聚酚。

酚型经基中的氢易被烃基、碳基取代而生成醚或醋，这是制造EP、PC、UP、聚芳酯、聚砜等的理论基础

1.2.双酚A使用现状

双酚A不仅是生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要基础原料，而且也是合成聚（芳）砜、聚芳酯、酚醛树脂、不饱和聚酯、聚醚酰亚胺和聚磺酸酯等高分子材料重要单体。

此外，它还被用于合成稳定剂、防老剂、增塑剂、阻燃剂、杀菌剂、油漆、油墨抗氧剂等多种化工产品。

　　历来，双酚A产量的90%以上都被用于环氧树脂和聚碳酸酯，所以有把双酚A质量按适合聚碳酸酯和环氧树脂要求而分级的作法。

1986～1991年期间全世界双酚A消费量年均增长率约6.5%，1991年消费量为94万t；目前消费量已超过140万t/a。

　　在相当长的时间里，用于生产环氧树脂的双酚A比用于生产PC的多得多。

随着PC的迅速发展，这种情况逐渐发生了变化；而用于生产PC的双酚A的年消费量超过用于环氧树脂的情况在美国、西欧、日本的转折年度分别为1976年、1980年、1985年。

近几年来，这种转变更加明显，它们间的差距还在不断扩大。

　　除了上述两大用途外，双酚A还被广泛用于其他生产部门；随国情的不同，分别约占其总消费量的4%一9%，按消费量的大致顺序是：

不饱和聚酯、阻燃剂（主要是四溴双酚A）、聚（芳）砜、聚芳酯、聚醚酰亚胺、稳定剂、防老剂、增塑剂、农用杀虫（菌）剂、油漆和油墨的抗氧剂等。

1.3.双酚A残留分布

双酚A在环境中主要存在于水体、污泥及沉积物中，由于它的挥发性低，故在大气中的存在量很少。

双酚A在生产、使用和处置过程中通过废水或废物进入水环境。

国外对双酚A的环境调查已经广泛展开：

Fromme等对德国116个地表水样品中双酚A的调查显示，双酚A的浓度为0.5mg/L～410mg/L；英国地表水的双酚A浓度介于0.5mg/L～16mg/L；日本Tama河河水中的双酚A浓度10～90ng/L；2002年李正炎等对位于韩国谣海岸京畿湾内的西瓦湖（ShihwaLake）调查显示，湖内表层水、悬浮物和沉积物中的双酚A浓度分别为6.7mg/L～37.8mg/L，O.4mg/L～3.5mg/L和3.4mg/L～50.5mg/g；国内梁增辉等在某市郊区水沟水样中检测到双酚A浓度范围5.6x10-3ug/L～1.52ug/L。

1.4.双酚A的残留危害性

双酚A是一种“环境激素”，具有雌激素活性，在人体内能起到干扰体内正常激素分泌的作用，从而影响生殖功能，导致恶性肿瘤的产生。

即使在摄入量极低的情况下，也会给人类健康造成危害。

欧美已严令限制这类化合物在包装材料、有机涂层和粘合剂中使用。

1.5.双酚A的降解

不同国家对双酚A的残留限量有不同的标准：

中国：

我国的卫生标准规定碳酸酯树脂和成型品中酚（蒸馏水，回流6h）的溶出量不大于O.05mg/kg，采用滴定的方法对溶液中游离的酚进行定量计算。

欧盟：

欧盟2002/72/EC法则规定双酚A在塑料食品接触材料中的迁移限量为3mg/kg。

欧盟采用液相色谱对双酚A的迁移量进行检测（检出限为O.2～0.7mg/kg）。

美国：

美国食品与药品管理局（FDA）规定双酚A可作为食品接触材料的原料使用。

EPA（1993）规定最大可接受剂量或者参考剂量是O.05mg/kg。

日本：

《食品卫生法》规定聚碳酸酯食品容器中的双酚A溶出限量为2.5mg/kg。

1.6.双酚A的检测方法

目前，BPA的检测方法有双波长分光光度法、气相色谱（GC）法、气相色谱-质谱（GC-MS）法，高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、极谱法，免疫分析法，荧光分析法、化学发光分析法等。

1.6.1气相色谱-质谱法（GC/MS）

目前这是检测PC制桶装饮用水中双酚A溶出情况的主要方法。

该法检测双酚A前处理简单，分析速度快，灵敏度高。

1.6.2高效液相色谱（HPLC）

高效液相色谱也是常用的方法，相对气相色谱而言，液相色谱分离条件更加温

和，因而更适合于双酚A的残留检测。

1.6.3极谱法

孙仕萍等将聚碳酸酯塑料用蒸馏水浸泡48h后，用二氯甲烷萃取，挥干二氯甲烷。

样品中的双酚A在80℃水浴中与硝酸反应生成硝基化合物。

该化合物可在示波极谱仪上产生一灵敏的二阶导数吸附波。

在5-150ug／L范围内峰电流与双酚A的含量呈良好线性关系。

方法检出限为2ug/L，相对标准偏差为0.9％--8.5％所得结果与HPLC法所得结果间无显著差异。

1.6.4荧光法

国外曾有人做过这方面的研究，唐舒雅等在pH为l的酸性介质中，利用β-环糊精对双酚A荧光强度的增强作用，建立了荧光分光光度法测定水中双酚A残留的简单灵敏的方法。

该法的线性范围为0.4-300.Oug/L，相对标准偏差为1.3％，检出限为0．020ug/L。

1.6.5免疫分析法

免疫分析（IA）是20世纪90年代优先研究开发和利用的残留分析技术之一。

它是利用抗原和抗体高度特异性的结合反应和抗体（或半抗原）上的标记物（酶、荧光物质、放射性同位素等）的生物或物理、化学放大作用来对超微量残留物进行定性定量检测。

该法简单、快速、分析容量大、成本低，不需要贵重仪器，可以大大简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专门技术要求不高，容易普及和推广。

若开发成试剂盒，可广泛用于现场样品和大量样品的快速监测。

建立免疫分析方法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体。

环境激素类化合物双酚A是小分子化合物质（分子量=228），本身不具有诱导免疫系统产生抗体的能力。

为此，必须先将小分子与载体蛋白质偶联制备出入工完全抗原。

如果双酚A不能直接与蛋白质共价偶联，则需先通过衍生过程在分子上产生活性功能团，以此作半抗原，再与蛋白质偶联。

多数小分子缺乏可直接与蛋白质相偶联的功能团，这就必须先合成半抗原。

双酚A分子内可在多个不同的位点引进活性功能团：

l.在甲基部位接上一个连接臂；2.芳香环羟基接上一个连接臂。

不同位点与蛋白质结合制备人工抗原产生的抗体与目标分析物的亲和力差异显著，这是因为不同位点结合导致半抗原空间构型或电子云分布与目标分析化合物有差异及空问位阻效应等。

魏孔吉等利用4，4-2双（4，2羟基苯基）戊酸作为半抗原，经活化后与蛋白质偶联，获得全抗原，免疫动物获得抗体，并建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8mg/L、抗体稀释为2.4x105倍，生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍。

在优化条件下，方法的线性范围0.2～1000ug/L；最低检出限O.051ug/L。

所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定，样品处理简单，结果满意。

1.7.双酚A（BPA）免疫分析依据

食品安全关乎国计民生。

保障食品安全是一项刻不容缓的任务。

随着双酚A在各个领域的广泛使用，对环境的威胁也越来越突出。

目前，欧盟、美国、日本、中国等国家和地区已明确公布了BPA的残留限量。

鉴于BPA的生理生殖毒性，因而加强BPA残留的检测显得尤为重要。

传统的BPA残留分析方法主要是气相色谱、液相色谱或者气质联用、液质联用等方法，这些方法存在着样品前处理要求高、一次只能分析一个样品、检测时间长、设备昂贵等问题。

与之相比，ELISA技术在大量样品的现场快速筛选方面有着无可比拟的独特优势。

但是目前国内实际应用的检测BPA的ELISA试剂盒很少，因此，需要建立LBPA免疫分析化学技术，进而开发自主知识产权的ELISA试剂盒。

本文拟从BPA上连接一个间隔臂，进而将其与载体蛋白偶联，免疫动物获得对双酚A具特异性亲和力的多克隆抗体，从而建立BPA残留的ELISA技术。

为进一步开发BPA的ELISA试剂盒奠定基础。

2.材料与方法

2.1.实验材料

2.1.1试剂与材料

双酚A

卤代酸酯

己烯雌酚

石油醚

丙酮

甲醇

氢氧化钠

氢氧化钾

辣根过氧化物酶

硅胶GF254

柱层析硅胶H

N，N-二甲基甲酰胺（DMF），分析纯

N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）

N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）

牛血清蛋白（BSA，MW67000）

卵清蛋白（OVA，MW45000）

酶标二抗（辣根酶标记山羊抗兔IgG/HRP）

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂

邻苯二胺（OPD）

乙二胺四乙酸（EDTA）

过氧化氢（30%），分析纯

浓硫酸（95%-98%），分析纯

透析袋（最大允许透过相对分子质量<7000）

96孔聚苯乙烯酶标板

新西兰大白兔（体重1.5-2.0kg）

2.1.2仪器

磁力搅拌器

紫外分析仪

旋转蒸发仪

核磁共振仪

液质联用仪

酶标免疫测定仪

高速冷冻离心机

电热恒温培养箱

移液枪单道5-50ul

单道20-200ul

单道50-1000ul

八道20-200ul

2.2.实验方法：

2.2.2双酚A抗原的合成与鉴定

2.2.3抗体的制备和纯化

2.2.3.1免疫抗原的乳化及免疫方案

用Hapten-BSA作为免疫原，免疫2只雄性新西兰大白兔。

基础免疫剂量为1.0mg/kg兔重，用生理盐水稀释免疫原到适当浓度，用等体积的弗氏完全佐剂（FCA）乳化免疫抗原，加强免疫剂量为1.5mg/kg兔重，用生理盐水稀释后，用弗氏不完全佐剂（FIA）乳化抗原，均采用注射器乳化法，直到滴入水中不分散。

基础免疫3周后进行加强免疫，以后每隔2周加免一次，共加免4次，具体免疫方案见表2-1

表2-1.烯唑醇人工抗原免疫方案

Table2-1.Theimmuneschemeoftheartificialantigensofdiniconazole

免疫时间（周）Time（weeks）

免疫原

ImmuneAg

免疫剂量（mg/kg兔重）

AmountofAg

免疫方法

Immunemethod

基础免疫

+等体积FCA

≈1.0

背部皮下多点注射

二免（间隔三周）

+等体积FIA

≈1.5

背部皮下多点注射

三免（间隔两周）

+等体积FIA

≈1.5

背部皮下多点注射

四免（间隔两周）

+等体积FIA

≈1.5

背部皮下多点注射

末免（间隔两周）

+等体积FIA

≈1.5

背部皮下多点注射

2.2.3.2采血和试血

基础免疫前1周，兔耳缘静脉采集阴性血清。

从第二次加强免疫开始，每次加免后的第8天，兔耳缘静脉采血1-2mL，装于试管中，于37℃水浴静置30min，使血球凝固，用针头剥离血球与试管壁，再置于4℃冰箱过夜，然后离心10min（4000r/min），取上清液作倍比稀释，用间接非竞争酶联免疫吸附测定法测定抗血清的效价（稀释倍数）。

待效价达到一定程度，心脏采血，分离抗血清。

2.2.3.3抗体纯化

采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体[118]。

取抗血清，用0.06M醋酸盐缓冲液（0.06mol/L，pH4.0）按1：

4（v/v）稀释，用0.1M的NaOH溶液调pH至4.5，室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（75µL/mL血清量），加毕，继续搅拌30min，在4℃下静置2h，离心30min（4℃，10000r/min），弃沉淀。

用PBS（0.1M，pH7.4）以1：

10稀释上清液，用1M的NaOH溶液调pH至7.4，4℃下预冷15min，加入（NH4）SO4（0.277g/mL），继续搅拌反应30min，4℃静置2-3h；离心30min（4℃，10000r/min），弃上清液，沉淀物用少量PBS（0.01M，pH7.4）溶解，用含有EDTA（74.4mg/L）的PBS（0.01M，pH7.4）透析2-3天（4℃），直到SO42-或NH4+完全除去，最后冷冻干燥，得到抗体冻干粉，存放在-20℃冰箱中。

2.2.4抗体效价测定及工作浓度的选择

采用间接非竞争ELISA法测定抗血清效价，用方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度。

选择当OD450值约为1.0时的包被抗原和抗体的浓度作为检测的工作浓度。

间接竞争ELISA法步骤如图：

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性，在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析

间接ELISA法基本操作方法如下:

<1>包被抗原：

用包被液将抗原作适当稀释，每孔加100ul稀释后的抗原。

加膜后放在37oC温箱温育2小时

<2>洗涤：

取出板放置恢复至室温后甩板倒尽孔中液体，每孔加200ul洗涤液，静置2min，甩板清除洗涤液，反复三次，最后拍板

<3>封闭：

每孔加150ul封闭液后加膜放37OC温箱培育1.5小时

<4>洗涤，同<2>

<5>加样:

将抗体倍比稀释50,100,200,400,800倍分别加于酶标板中，100ul/孔，空白对照孔不加抗体而加入100ul稀释液，37OC温箱温育30min

<6>洗涤，同<2>

<7>加酶标二抗：

用稀释液把酶标二抗稀释4000倍，100ul/孔，37OC温箱温育30min

<8>洗涤，同<2>

<9>显色，每孔加入100ul显色液，放置37OC温箱避光显色15min

<10>洗涤，同<2>

<11>终止反应：

50ul/孔终止液快速加入酶标板中，于酶标仪上读取450nm处吸光值

2.2.5标准曲线的建立

配置浓度为0、0.01、005、0.1、0.5、1、5mg/L的双酚A标准溶液，采用上述ELISA法考察双酚A对抗原抗体结合反应的抑制活性。

根据结合率（B/B0）与农药浓度的对数值作图，绘制双酚A的竞争曲线，得到抑制中浓度（IC50）及最低检测限（IC10）。

B/B0（%）＝[（ODx-ODmin）/（ODmax-ODmin）]×100

式中：

ODmax为不加药时的吸光值，ODX为农药浓度为X时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。

2.2.6水中的添加回收试验

量取自来水5ml两份，添加双酚A液使自来水中双酚A含量为0.1mg/L，0.05mg/L，以同样稀释浓度的双酚A稀释液为对照，采用ELISA法进行分析，计算回收率

回收率=（测定值/添加量）X100%

3.结果与分析

3.1.抗体工作浓度的选择

用间接非竞争ELISA法对得到的抗体进行鉴定，方阵滴定结果表明得到的抗体对包被抗原具有很高的结合效价，2.0×105确定抗原与抗体的最适工作浓度分别为稀释200倍时的浓度。

具体结果见下表：

抗体浓度

抗原稀释倍数

100

2

400

800

1600

30000

1.532

1.369

0.987

0.642

0.475

60000

1.325

1.140

0.871

0.526

0.405

120000

1.278

1.015

0.790

0.468

0.357

400

0.874

0.741

0.531

0.315

0.214

800

0.475

0.322

0.284

0.192

0.158-

3.2.标准曲线的建立

配置浓度为0、0.01、005、0.1、0.5、1、5mg/L的双酚A标准溶液，通过间接竞争ELISA法通过酶标仪测出在450nm处的吸光值，得出标准曲线如下图：

双酚Aic-ELISA标准曲线

相关分析得到回归方程Y=-15.58X+14.01（Y为结合率，X为农药浓度对数，R2=0.979），抑制率

3.3.样品添加回收率的测定

在自来水添加不同浓度的的双酚A标样，按照ic-ELISA进行测定，检测结果见表：

样品

Sample

添加浓度（mg/L,mg/kg）

Spikedconcentration

平均回收率（%，n=3）

Meanrecovery

变异系数（%）

CV

自来水

Tapwater

0.1

108.18+2.16

2.00

0.05

99.04+2.30

2.38

可以看出双酚A在自来水在自来水中回收率在99.04%-108.18%之间，变异系数在2.00%-2.38%之间。

可以得出该方法适用于双酚A在自来水中的残留测定。

4.讨论

4.1.抗原的合成

人工抗原决定了抗体的特异性和亲和性，最终影响免疫分析的质量。

抗原的合成包括两部分内容，一个是半抗原的设计和合成，一是人工抗原的合成。

半抗原合成的四个关键因素是：

连接臂的位置、长度、性质、及末端的功能基团，因此必须遵循在尽可能保留原待测物特征结构的前提下，在适当的位置引入合适的连接臂和功能基团的原则。

同时半抗原的纯度也对特异性抗体的产生起着关键的作用，这通过相应的光谱来确证。

人工抗原的合成的关键步骤包括载体的选择，偶联方法、条件，和人工抗原的纯化。

这期间的每一步的操作都影响着抗体的质量高低。

而本试验所设计合成的半抗原，基本遵循了上述的原则，合成的抗原用紫外吸收光谱鉴定，偶联成功，得到免疫原和包被原的结合比分别为17:

1和5:

1。

本试验中采用了相同的方法合成了烯唑醇和烯效唑半抗原，二者的结构也很相似，最终产生的抗烯效唑抗体具有比烯唑醇高很多的结合效价，但是灵敏度和烯唑醇相比偏低，可能原因：

抗原的纯度不够，含有的杂质影响了抗体的质量；在免疫过程中的和抗体纯化过程中操作的误差影响了分析的灵敏度。

同时也说明，抗体的效价高低与灵敏度的高低没有直接的关系，高效价的抗体不一定会得到高灵敏度，但是分析过程中需要抗体效价达到一定高度才能满足测定的需要。

4.2.包被原的制备

包被原的水溶性直接影响包被效果。

由于双酚A半抗原水溶性不好，如果包被原处理不当，将很难溶解，从而影响包被效果。

本文采用OVA作为制备包被原的载体蛋白，OVA的水溶性本身就比BSA差，所以在偶联制备包被原时投料比作了适当降低，以防结合比过大，导致包被原溶解性很差。

4.3.pH值对抗原抗体结合反应的影响

对于本实验制备的抗体，近中性的pH更有利于抗原抗体的结合反应。

其原因可能是近中性的pH环境更有利于偶联于包被原上的半抗原的酚羟基保持酚羟基的特征，而不是变成游离的氧负离子。

这样近中性的pH环境接近生理条件，有利

于抗体对双酚A的识别，从而有利于抗原抗体结合反应。

但是过低的pH可能会影响抗体的活性，因此适当的pH的反应介质对抗原抗体的结合反应尤为重要。

4.4.有机溶剂对抗原抗体结合反应及BPA抑制的影响

实验结果表明：

有机溶剂的存在对抗原抗体的结合反应产生一定的影响，整体上随着有机溶剂浓度的增大，抗原抗体的结合能力减弱，在低浓度的丙酮存在时。

抗原抗体反应能力略有增强。

乙腈的存在对BPA抑制的影响不是很明显，而甲醇的存在，对BPA抑制的影响相当大，因而在做ELISA检测时，应避免高浓度有机溶剂的存在。

4.5.样品中双酚A的ic-ELISA分析

免疫分析是基于抗原抗体的特异性反应来识别和测定待测物，但是分析样品中的基质可能会影响测定的结果。

基质效应主要是通过改变抗体与抗原的结合位点、抗体蛋白质的变性、抗体被其他不溶物吸附等作用，最后导致测定结果的不准确。

在该试验中，通过简单的净化处理，除去了大部分的基质，然后用缓冲液来稀释提取液，减少基质对免疫分析的干扰。

本研究建立的ELISA方法，样品前处理简单、快速，样品中的基质对测定结果可能有影响，但是通过对基质进行稀释，影响不显著，该方法可同时测定多个样品，回收率较为理想，符合农药残留快速检测的要求。

5.全文小结