大肠系统表达及纯化操作指南.docx

大肠系统表达及纯化操作指南.docx

《大肠系统表达及纯化操作指南.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠系统表达及纯化操作指南.docx（9页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

大肠系统表达及纯化操作指南

大肠系统小量表达蛋白的操作指南

1，第一天9：

00：

挑一个单克隆到1.5mlLB（K+）液体培养基中（试管中），37℃，200rpm培养。

2，培养至OD=0.6~0.8，IPTG诱导（3ulIPTG/支试管），37℃，200rpm培养2h。

3，收菌：

取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm，离心1min，取1管弃上清，沉淀用30~100ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，转至1管中，超声处理，超声5秒，停5秒，超20次，功率200W，13000rpm，离心10min，取50ul上清至另一EP管，加50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳，上清去除干净后沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

大肠系统大量表达操作指南（方案一）

1，第一天10：

00：

接10ul保菌液到1~2mlLB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，活化菌种。

2，17：

00：

接1~2ul活化的菌液到250mlLB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。

3，第二天9：

00：

过夜培养的250ml菌液与等体积LB（K+）液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD=0.6~0.8，IPTG诱导（125ulIPTG/250ml菌液），2h后收菌。

4，小样收菌检测：

取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm，离心1min，弃上清，取1管，沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，转至1管中，超声处理，超声5秒，停5秒，超20次，功率200W，13000rpm，离心10min，取50ul上清至另一EP管，加50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳，上清去除干净后沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

5，大量收菌：

50ml圆底离心筒，12000rpm，离心2min。

弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声，超声20秒，停20秒，超50次，功率400W，13000rpm，离心10min，根据小样超声的电泳结果决定留上清还是留沉淀（包涵体）。

大肠系统大量表达操作指南（方案二）

1，第一天17：

00：

取保菌的菌液平板划线，37℃，过夜培养，活化菌种。

2，第二天9：

00：

划线的平板4℃保存。

15：

00：

挑一个单克隆接到5mlLB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。

3，第三天9：

00：

过夜培养的5ml菌液转接到250ml的LB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD=0.6~0.8，IPTG诱导（125ulIPTG/250ml菌液），2h后收菌。

4，小样收菌检测：

取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm，离心1min，弃上清，取1管，沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，转至1管中，超声处理，超声5秒，停5秒，超20次，功率200W，13000rpm，离心10min，取50ul上清至另一EP管，加50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳，上清去除干净后沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

5，大量收菌：

50ml圆底离心筒，12000rpm，离心2min。

弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声，超声20秒，停20秒，超50次，功率400W，13000rpm，离心10min，根据小样超声的电泳结果决定留上清还是留沉淀（包涵体）。

大肠系统大量表达操作指南（方案三）

1，第一天10：

00：

接10ul保菌液到1~2mlLB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，活化菌种。

2，第一天17：

00：

接1~2ul活化的菌液到5mlLB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。

3，第二天9：

00：

过夜培养的5ml菌液转接到250ml的LB（K+）液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD=0.6~0.8，IPTG诱导（125ulIPTG/250ml菌液），2h后收菌。

4，小样收菌：

取5只1.5ml的EP管，每管加入1ml菌液，13000rpm，离心1min，弃上清，取1管，沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

另4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，转至1管中，超声处理，超声5秒，停5秒，超20次，功率200W，13000rpm，离心10min，取50ul上清至另一EP管，加50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳，上清去除干净后沉淀用50ul10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul2×溴酚蓝Buffer，100℃煮5min，电泳。

5，大量收菌：

50ml圆底离心筒，12000rpm，离心2min。

弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声，超声20秒，停20秒，超50次，功率400W，13000rpm，离心10min，根据小样超声的电泳结果决定留上清还是留沉淀（包涵体）。

大肠系统表达的包涵体蛋白小量预洗的操作指南

1，20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀（500ml菌液所得），

2，取1ml于EP管中，13000rpm，离心2min。

弃上清。

3，1.2mlBufferB重悬沉淀，摇动或静置3h。

4，13000rpm，离心2min，弃上清（上清留50ul做电泳对比）。

5，1.2ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，13000rpm，离心2min，弃上清。

6，重复5一次。

7，1.2ml含2M尿素的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，室温静置15min。

13000rpm，离心2min，弃上清（上清留50ul做电泳对比）。

8，1.2ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀

9,重复8一次。

10，1.2ml含8M尿素的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，取50ul小样电泳。

大肠系统表达蛋白的大量洗涤的操作指南

一、包涵体的纯化

1，20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀（500ml菌液所得），12000rpm，离心10min。

弃上清。

2，20~30mlBufferB重悬沉淀，摇动或静置3h。

3，12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存（上清留50ul做电泳对比）。

4，20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，12000rpm，离心10min，弃上清。

5，重复4一次。

6，20~30ml含2M尿素的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，室温静置30min。

12000rpm，离心10min，上清转入另一离心管中（上清留50ul做电泳对比）。

7，20~30ml10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀。

8，重复7一次。

9，先加入1~2ml的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5~10ml含8M尿素的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重新溶解沉淀（先加5~10ml，如溶解不好，可增加溶液体积至15~20ml），取50ul小样电泳。

10，上清和沉淀冷冻之前均需要加适量的甘油。

BufferB含有：

5%Triton

50mMTris-HCl（pH8.0）

50mM氯化钠

5mMEDTA

镍柱亲和层析

1，填柱，注意不能有气泡。

2，用纯水洗柱，至pH7.0.（流速7）

3，挂镍，至pH2~3.（流速7）

4，纯水洗柱至pH7.0（流速7）

5，10mMTris-HCl（pH8.0）溶液平衡镍柱，约80ml（流速7）。

6，含0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液平衡镍柱，约80~100ml。

（流速7）

7，标定紫外检测器，A调0，T调95.

8，上样。

样品需要事先加入氯化钠，终浓度为0.5M。

注意流速要慢（3~4）。

9，上样结束后，用含0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液洗柱，至OD很低且稳定。

（流速7）

10，15mM咪唑0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液，40ml（0.5MNaCl的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液中加1.5M咪唑0.4ml），洗脱，收集蛋白峰。

（流速7）

11，60mM咪唑0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液，40ml（0.5MNaCl的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液中加1.5M咪唑1.6ml），洗脱，收集蛋白峰。

（流速7）

12，300mM咪唑0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液，40ml（0.5MNaCl的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液中加1.5M咪唑8ml），洗脱，收集蛋白峰。

（流速7）

13，拆柱，处理填料。

NiSepharose6FastFlow非变性条件纯化蛋白Protocol

一，NiSepharose6FastFlow介质的预处理

1，轻柔震荡，使介质均匀重悬。

2，取1.5ml混悬液（介质净体积1ml，）/柱，转入15ml离心管中，2500rpm，离心5min，弃上清。

3，加入5ml双蒸水/柱，轻柔震荡3min，2500rpm，离心5min，弃上清。

4，加入5mlBufferB/柱，轻柔震荡3min，2500rpm，离心5min，弃上清。

5，重复4一次。

6，加入1ml/柱的BufferB，制成2ml/柱的50%的混悬液，装柱。

二，样品的纯化

1，样品（10mMTris-HCl（pH8.0）体系）溶液中加入咪唑和氯化钠，使中体系为10mMTris-HCl（pH8.0）,500mMNaCl,30mM咪唑,pH8.0。

12000rpm，离心10min。

留50ul小样，电泳。

2，样品溶液加入层析柱，收集流出液，留小样电泳。

3，10mlBufferB洗柱，分别接第1ml，第6ml和第10ml，电泳

4，10mlBufferW洗柱，分别接第1ml，第6ml和第10ml，电泳

5，10mlBufferE洗脱，每ml接一个EP管中，第1，2，3，4，7管电泳

三，介质的清洗和再生

1，5~10mlBufferS洗柱。

2，5~10mlBufferB洗柱。

3，5~10ml双蒸水洗柱。

4，1.0ml0.1MNiSO4过柱。

5，5~10ml双蒸水洗柱。

6，5~10mlBufferB洗柱。

BufferB（Bindingbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,500mMNaCl,30mM咪唑,pH8.0

BufferW（washbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,500mMNaCl,100mM咪唑,pH8.0

BufferE（Elutionbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,500mMNaCl,300mM咪唑,pH8.0

BufferS（strippingbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,500mMNaCl,50mMEDTA,pH8.0

NiSepharose6FastFlow变性条件纯化蛋白Protocol

一，NiSepharose6FastFlow介质的预处理

2，轻柔震荡，使介质均匀重悬。

2，取0.75ml混悬液（介质净体积0.5ml，）/柱，转入15ml离心管中，2500rpm，离心5min，弃上清。

3，加入3ml双蒸水/柱，轻柔震荡3min，2500rpm，离心5min，弃上清。

4，加入3mlBufferB/柱，轻柔震荡3min，2500rpm，离心5min，弃上清。

5，重复4一次。

6，加入0.5ml/柱的BufferB，制成1ml/柱的50%的混悬液，装柱。

二，包涵体样品的纯化

1，包涵体沉淀先用1ml不含尿素的BufferB吹散，再用10~20ml含尿素的BufferB溶解，12000rpm，离心10min，上清上柱。

留50ul小样，电泳。

2，样品溶液加入层析柱，收集流出液，留小样电泳。

3，5mlBufferB洗柱，接第1ml，电泳

4，5mlBufferW1洗柱，接第1ml，电泳

5，5mlBufferW2洗柱，接第1ml，电泳

6，5mlBufferE洗脱，每ml接一个EP管中，第1，2，3，管电泳

三，介质的清洗和再生

1，5mlBufferS洗柱。

2，5mlBufferB洗柱。

3，5ml双蒸水洗柱。

4，0.5ml0.1MNiSO4过柱。

5，5ml双蒸水洗柱。

6，5mlBufferB洗柱。

BufferB（Bindingbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,8M尿素，500mMNaCl,pH8.0

BufferW1（washbuffer1）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,8M尿素，500mMNaCl,15mM咪唑,pH8.0

BufferW2（washbuffer2）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,8M尿素，500mMNaCl,60mM咪唑,pH8.0

BufferE（Elutionbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,8M尿素，500mMNaCl,300mM咪唑,pH8.0

BufferS（strippingbuffer）:

10mMTris-HCl（pH8.0）,8M尿素，500mMNaCl,50mMEDTA,pH8.0