荧光光谱分析.docx

荧光光谱分析.docx

《荧光光谱分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光光谱分析.docx（26页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

荧光光谱分析

第十七章荧光光谱分析

当紫外线照射到某些物质的时候,这些物质会发射出各种颜色与不同强度的可见光,而当紫外线停止照射时,所发射的光线也随之很快地消失,这种光线被称为荧光。

西班牙的内科医生与植物学家N、Monardes于1575年第一次记录了荧光现象。

17世纪,Boyle与Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。

17世纪与18世纪,又陆续发现了其它一些发荧光的材料与溶液,但就是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。

1852年,Stokes在考察奎宁与叶绿素的荧光时,用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长,才判明这种现象就是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光,而不就是由光的漫射所引起的,从而导入了荧光就是光发射的概念。

同时,她由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。

1867年,Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作,应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。

1880年,Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。

到19世纪末,人们已经知道了600种以上的荧光化合物。

20世纪以来,荧光现象被研究得更多了。

例如,1905年Wood发现了共振荧光;1914年Frank与Hertz利用电子冲击发光进行定量研究;1922年Frank与Cario发现了增感应光;1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定;1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。

荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。

19世纪以前,荧光的观察就是靠肉眼进行的,直到1928年,才由Jette与West研制出第一台光电荧光计。

早期的光电荧光计的灵敏度就是有限的,1939年Zworykin与Rajchman发明光电倍增管以后,在增加灵敏度与容许使用分辨率更高的单色器等方面,就是一个非常重要的阶段。

1943年Dutton与Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤,1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置,到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。

荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测与定量测定的手段之外,还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。

例如,在生命科学领域的研究中,人们经常可以利用荧光检测的手段,通过检测某种荧光特定参数（如荧光的波长、强度、偏振与寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质与构象上的变化。

很多化合物由于本身具有大的共轭体系与刚性的平面结构,因而具有能发射荧光的内在本质,我们称这些化合物为荧光化合物。

在某些所要研究的体系中,由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光,人们就可以利用其内源荧光,通过检测某种荧光特性参数的变化,对该体系的某些性质加以研究。

但就是,如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光,或者其内源性质很弱,这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针,再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。

例如,如果我们要检测体系的极性,便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中,然后通过对荧光探针的荧光特性的检测,求得体系的极性,或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。

荧光分析法之所以发展如此迅速,应用日益广泛,其原因之一就是荧光分析法具有很高的灵敏度。

在微量分析的各种方法中,应用较为广泛的有比色法与分光光度法。

但在方法的灵敏度方面,荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2～3各数量级。

随着现代电子技术的迅速发展,对于微弱光信号检测的灵敏度已大大提高,荧光分析的灵敏度常可达亿分之几,在与毛细管电泳分离技术结合、采用激光诱导荧光检测法时,已能接近或达到单分子检测的水平[1]荧光分析法的另一个优点就是选择性高。

这主要就是对有机化合物的分析而言。

吸光物质由于内在本质的差别,不一定都会发荧光,况且,发荧光的物质彼此之间在激发波长与发射波长方面可能有所差异,因而通过选择适当的激发波长与荧光测定波长,便可能达到选择性测定的目的。

另外,由于荧光的特性参数较多,除量子产率、激发与发射波长之外,还有荧光寿命、荧光偏振等。

因此,还可以通过采用同步扫描、导数光谱、三维光谱、时间分辨与相分辨等一些荧光测定新技术进一步提高测定的选择性。

除灵敏度高与选择性好之外,动态线性范围宽,方法简便,重现性好,取样量少,仪器设备不复杂等等,也就是荧光分析法的优点。

近年来,在其她学科迅速发展的影响下,激光、微处理机、电子学、光导纤维与纳米材料等方面的一些新技术的引入,很大程度上推动了荧光分析法在理论与应用方面的进展,促进了诸如同步荧光测定、倒数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术与荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展,并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世,使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观、实时、原位与自动化的方向发展,方法的灵敏度、准确度与选择性日益提高,方法的应用范围大大扩展,遍及工业、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学与公安情报等诸多领域。

如今,荧光分析法已经发展成为一种十分重要且有效地光谱化学分析手段。

17、1基本原理

荧光就是一种光致发光现象,那么,由于分子对光的选择性吸收,不同波长的入射光便具有不同的激发频率。

如果固定荧光的发射波长（即测定波长）而不断改变激发光（即入射光）的波长,并记录相应的荧光强度,所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称激发光谱）。

如果使激发光的波长与强度保持不变,而不断改变荧光的测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度,所得到的荧光强度对发射波长的谱图则称为荧光的发射光谱（简称发射光谱）。

激发光谱反映了在某一固定的发射波长下所测量的荧光强度对激发波长的依赖关系;发射光谱反映了在某一固定的激发波长下所测量的荧光的波长分布。

激发光谱与发射光谱可用以鉴别荧光物质,并可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长与测定波长的依据。

荧光测量仪器有各自的特性,如光源的能量分布、单色器的透射率与检测器的敏感度都随波长而改变,因而一般情况下测得的激发光谱与发射光谱,皆为表观的光谱。

同一份荧光化合物的溶液在不同的荧光测量仪上所测得的表观光谱彼此间往往有所差异。

只有对上述仪器特性的波长因素加以校正之后,所获得的校正光谱（或称真就是光谱）才可能就是彼此一致的。

某种化合物的荧光激发光谱的形状,理论上应与其吸收光谱的形状相同,但就是由于上述仪器特性的波长因素,表光激发光谱的形状与吸收光谱的形状大都有所差异,只有校正的激发光谱才与吸收光谱非常接近。

在化合物的浓度足够小,对不同波长激发光的吸收正比于其吸光系数,且荧光的量子产率与激发波长无关的条件下,校正的激发光谱在形状上与吸收光谱相同。

分子的吸收光谱可能含有几个吸收带,但其发射光谱却通常只含有一个发射带。

绝大多数情况下即使分子被激发到S2电子态以上的不用振动能级,但就是由于内转化与振动松弛的速率就是那样的快,以致很快地丧失多余的能量而衰变到S1态的最低振动能级,然后发射荧光,因而其发射光谱通常只含一个发射带,且发射光谱的形状与激发波长无关,只与基态中振动能级的分布情况以及各振动带的跃迁概率有关。

但就是也有例外,例如有些荧光体具有两个电离态,而每个电离态显示不同的吸收与发射光谱,等等。

物质在吸收入射光的过程中,光子的能量传递给了物质分子。

分子被激发后,发生了电子从较低的能级到较高能级的跃迁。

该跃迁过程经历的时间约10-15s。

跃迁所涉及的两个能级间的能量差,等于所吸收光子的能量。

紫外、可见光区的光子能量较高,足以引起分子中的电子发生电子能级间的跃迁。

处于该激发态的分子称为电子激发态分子。

电子激发态的多重态用2S+1表示,S就是电子自旋角动量量子数的代数与,其数值为0或1。

分子中同一轨道里同一轨道里所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向,即自选配对。

如果分子中的全部电子都就是自旋配对的,即S=0,该分子便处于单重态（或称单线态）,用符号S表示。

大多数有机物分子的基态就是处于单重态的。

如果分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化,这时分子处于激发的单重态;倘若电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变,这时分子便具有两个自旋不配对的电子,即S=1,分子处于激发的三重态（或称三线态）,用符号T表示。

符号S0、S1与S2分别表示分子的基态、第一与第二电子激发单重态,T1与T2则分别表示第一与第二电子激发三重态。

处于激发态的分子不稳定,它可能通过辐射跃迁与非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。

另外,激发态分子也可能由于分子间的作用过程而失活。

辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射,即产生荧光活磷光;非辐射跃迁的衰变过程,包括振动松弛（VR）、内转化（ic）、与系间窜越（isc）,这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。

振动松弛就是指分子将多余的振动能量传递给介质而衰变到同一电子态的最低振动能级的过程。

内转化指相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过程（例如S1～S0,T2～T1）;系间窜越则指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过程（例如S1～T1,T1～S0）。

图5、6、1为分子内所发生的激发过程以及辐射跃迁与非辐射跃迁过程的示意图。

图5、6、1分子内的激发与衰变过程

A1、A2、吸收;F、荧光;P、磷光;ic、内转化;isc、系间窜越;VR、振动松弛、

如果分子被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上,处于这种激发态的分子很快（约10-12～10-14s）发生振动松弛而衰变到该电子态的最低振动能级,然后又经由内转化及振动松弛而衰变到S1态的最低振动能级。

接着,有如下几种衰变到基态的途径:

①S1→S0的辐射跃迁而发射荧光;②S1～S0内转化;③S1～T1系间窜越。

而处于T1态的最低振动能级的分子,则可能发生T1～S0的辐射跃迁而发射磷光,也可能同时发生T1～S0系间窜越。

从比较荧光与激发光的波长这一角度出发,荧光又可分为斯托克斯（Stokes）荧光、反斯托克斯荧光以及共振荧光。

斯托克斯荧光的波长比激发光源的长,反斯托克斯荧光的波长则比激发光源的短,而共振荧光具有与激发光相同的波长。

在溶液中观察到的通常就是斯托克斯荧光。

由荧光在电磁辐射中所处的波段范围,又有X射线荧光、紫外荧光、可见荧光与红外荧光之分。

17、2基本构成及其工作原理

荧光光谱仪由光源、单色器（滤光片或光栅）、狭缝、样品室、信号检测放大系统与信号读出、记录系统组成。

光源用来激发样品,单色器用来分离出所需要的单色光,信号检测放大系统用来把荧光信号转化为电信号,联结于放大装置上的读出装置用来显示或记录荧光信号。

下面介绍现用仪器（即法国HoribaJobinYvon生产的FluorLog-3荧光光谱仪）的各组件。

1、激发光源

理想化的激发光源:

由于荧光体的荧光强度与激发光的强度成正比,因此,作为一种理想的激发光源应具备:

①足够的强度;②在所需光谱范围内有连续的光谱;③其强度与波长无关,即光源的输出应就是连续平滑等强度的辐射;④光强要稳定。

符合这些要求的光源实际上并不存在。

可作为激发光源的主要有氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器以及闪光灯。

高压氙弧灯就是荧光光谱仪中应用最广泛的一种光源。

本仪器所用的激发光源即为450W氙灯。

这种光源就是一种短弧气体放电灯,外套为石英,内充氙气,室温时其压力为5atm,工作时压力约为20atm。

250～800nm光谱区呈连续光谱,450nm附近有几条锐线。

其工作时,在相距约8mm的钨电极间形成一强的电子流（电弧）,氙原子与电子流相撞而离解为氙正离子,氙正离子与电子复合而发光。

氙原子的离解发射连续光谱,而激发态的氙则发射分布于450nm附近的线状光谱。

氙弧灯的光谱输出,短于280nm区的强度迅速下降。

有的氙弧灯为无臭氧灯,即工作时氙灯周围不产生臭氧,这种灯所用的石英外套不投射波长短于250nm的光,但这种灯的输出信号强度随波长缩短而迅速下降。

工作时,氙灯灯光很强,其射线会损伤肉眼视网膜,紫外线会损伤肉眼角膜,因此,工作者应避免直视光源。

2、单色器与滤光片

⑴光栅单色器

光栅单色器有两个主要性能指标,即色散能力与杂散光水平,色散能力通常以nm/mm表示,其中mm为单色器的狭缝宽度。

通常人们总就是选用低杂散光的单色器,以减少杂散光的干扰,同时选用高效率的单色器来提高检测弱信号的能力。

单色器一般都有进、出光两个狭缝,出射光的强度约与单色器狭缝宽度的平方成正比,增大狭缝宽度有利于提高信号强度,缩小狭缝宽度有利于提高光谱分辨力,但却牺牲了信号强度。

对于光敏性的荧光体测量,有必要适当减少入射光的强度。

光栅单色器的透射率为波长的函数,机刻光栅的输出最强光的波长被称为闪耀波长。

光栅的闪耀波长由光栅的闪耀角而定,而闪耀角则由光栅的线槽角而定。

为了弥补激发光源（氙灯）紫外区能量弱的缺点,荧光光谱仪多选用闪耀波长落于紫外区（例如300nm）的单色器为激发单色器。

由于荧光体的荧光波长多落于400～600nm,因而发射单色器常采用闪耀波长为500nm左右的光栅。

光栅单色器的另一重要特性在于它的透射率与偏振光有关。

对于荧光测量来说,单色器的杂散光指标就是一个极关键的参数。

杂散光被定义为除去所需要波长的光线以外,通过单色器的所有其她光线的强度。

首先考虑激发单色器,通常紫外线被用来激发荧光体,而氙灯中的紫外线强度仅约为可见光的1%。

荧光体的荧光一般都很弱,通过激发单色器的长波长的杂散光,容易被当做荧光来检测。

许多生物样品都有较大的浊度,结果入射的杂散光被样品散射而干扰荧光强度的测量。

因此,某些荧光光谱仪采用双光栅单色器,这样,虽然杂散光可降至峰强度的10-8～10-12,可就是其灵敏度也将降低。

⑵滤光片

荧光测量的主要误差来自杂散光与散射光。

消除这些误差源除用单色器外还可用滤光片。

滤光片具有便宜、简单等优点,因此它在荧光光谱仪中有广泛的应用。

滤光片可分为玻璃滤光片、胶膜滤光片与干涉滤光片三种。

本仪器所用的就是玻璃滤光片。

玻璃滤光片含有各种不同的金属氧化物,因而呈现不同的颜色。

它们透过的光线带宽较宽,且因受金属氧化物种类的限制,品种不多。

但它具有稳定、经得起长期光照与便宜等优点。

3、检测器

检测器主要包括光电倍增管（PMT）、光导摄像管（Vidicon）、电子微分器与电荷耦合器件阵列检测器（charge-coupleddevice,CCD）。

目前,几乎所有普通荧光光谱仪都采用光电倍增管（PMT）作为检测器。

PMT就是一种很好的电流源,在一定的条件下,其电流量与入射光强度成正比。

虽然PMT对各个光子均起响应,但就是平时都就是测量众多光子脉冲响应的平均值。

光导摄像管被用来作为光学多道分析器（简称OMA）的检测器,它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用与寿命长等优点。

与PMT相比,其检测灵敏度虽不如PMT,但却能同时接受荧光体的整个发射光谱,这有利于光敏性荧光体与复杂样品的分析,且检测系统容易实现自动化[2]。

获得导数（亦称微分）光谱的方式有两类,一为光谱信号输出的微分,它包括电子微分、数字微分、机械转速微分;另一类为改变光路结构,例如波长调制等。

荧光光谱仪采用电子微分或微处理机微分[3-4]。

电荷耦合器件阵列检测器（charge-coupleddevice,CCD）就是一类新型的光学多通道检测器,它具有光谱范围宽、量子效率高、暗电流小、噪声低、灵敏度高、线性范围宽,同时可获取彩色、三维图像等特点。

CCD就是一种灵敏的固体成像装置,一般来说CCD的有效成像面积为1～8cm2。

现在商品型号的CCD有576*384像素、5126*512像素、1024*1024像素、400万像素、800万像素等系列产品[5-6]。

本中心配备的荧光光谱仪的检测器就是R928PPMT（photomultiplier-tube,光电倍增管）。

PMT由一个光阴极与多级的二次发射电极所组成。

光照射于光阴极时会引起一次电子发射,这些光电子在PMT中被电场加速飞射到第一个二次发射极（打拿极）上时,每个光电子将引起5～20个二次电子发射,这些电子又被加速到下一个电极上去,如此多次重复,最后电子被集中到阳极上去。

所产生的电流被放大到可检测的水平。

PMT的光电子产生率与施加于光阴极的高压值有关,一般PMT常用-500～-1000V的电压,有些型号的PMT则用-1000～-2000V。

电压越高,每个二次电极发射的电子越多,因而PMT本身的放大作用就越大。

PMT的灵敏度受暗电流的限制,而暗电流主要由阴极与二次发射极的热电子发射与电极间的漏电流所形成。

电极间电压低时,暗电流主要来自漏电流;电极电压高时,则主要来自热电子发射。

4、读出装置

以前,荧光仪器的读出装置有数字电压表、记录仪（x～y型或x～t型）与阴极示波器等几种。

数字电压表用于例行定量分析,既准确、方便又便宜。

记录仪多用于扫描激发光谱与发射光谱,它可分为x～y记录仪与x～t记录仪两种。

x～y记录仪的x轴表示荧光强度,它由光电检测器的输出来驱动其记录笔于相应的荧光强度位置,y轴表示波长,它与单色器扫描速度同步。

x～y记录仪可来回反复扫描,其价格约为x～t记录仪的一倍。

x～t记录仪的x轴显示荧光强度,t轴表示与时间有关的波长,它只能进行单向扫描。

记录仪记录笔的响应时间一般为0、1～0、5s。

阴极示波器显示的速度比记录仪快得多,可就是质量好的阴极示波器其价格比记录仪高得多。

目前,计算机软硬件技术的发展使得人们可以根据不同的需要选择不同的直观的视频读出方式。

17、3实验技术

17、3、1实验方法的选择

在荧光分析中,可以采用不同的实验方法以进行分析物质浓度的测量。

其中最简单的就是直接测定的方法。

只要分析物质本身法荧光,便可以通过测量其荧光强度以测定其浓度。

许多有机芳族化合物与生物物质有内在的荧光性质,通常可以直接进行荧光测定。

若有其她干扰物质存在时,则应预先采用掩蔽或分离的办法加以消除。

对于有些物质,它们或者本身不发荧光,或者因荧光量子产率很低而无法进行直接测定,便只能采用间接测定的办法。

间接测定的办法有多种,可按分析物质的具体情况加以适当的选择。

第一种方法就是荧光衍生化的办法,即通过某种手段使本身不发光的待分析物质转变为另一种发荧光的化合物,再通过测定该化合物的荧光强度,可间接测定待分析物质。

例如许多无机金属离子的荧光测定方法,就就是通过使它们与某些金属螯合剂反应生成具有荧光的螯合物之后加以测定的[7-8]。

某些不发光的有机化合物,可以通过降解反应、氧化还原反应、偶联反应、缩合反应、酶催化反应或光化学反应等办法,使它们转化为荧光物质。

例如维生素B1本身不发荧光,但可在碱性溶液中用铁青化钾等一些氧化剂将它氧化为发荧光的硫胺荧[9]。

如果分析物质本身不发荧光,但却具有能使某种荧光化合物荧光猝灭的能力,由于荧光猝灭的程度与分析物质的浓度有着定量的关系,那么,通过测量荧光化合物荧光强度的下降程度,便可间接地测定该分析物质。

例如大多数过渡金属离子与具有荧光性质的芳族配位体配合后,往往使配位体的荧光猝灭,从而可间接测定这些金属离子[10-11]。

倘若待分析物质不发荧光,但可以通过选择合适的荧光试剂作为能量受体,在待分析物质受激发后,通过能量转移的办法,经由单重态-单重态（或三重态-单重态）的能量转移过程,将激发能传递给能量受体,使能量受体分子被激发,再通过测定能量受体所发射的发光强度,也可以对分析物进行间接测定。

例如在滤纸上用萘作敏化剂以测定低浓度的蒽时,可使蒽的检测限提高达3个数量级。

以此类推,低浓度的菲也可由萘敏化而产生较强的荧光[12]。

在荧光分析中,由于每种荧光化合物具有本身的荧光激发光谱与发射光谱,因而在测定时相应的有激发波长与发射波长两种参数可供选择,这在混合物的测定方面比分光光度法具有更有利的条件,有时可简单地通过选择合适的激发波长或发射波长,达到选择性测定混合物中某种组分的目的。

在选择激光波长与发射波长之后仍无法达到混合物中各组分的分别测定时,还可仿照分光光度法中联合测定并解联立方程式的办法;对于混合物的荧光联合测定,也有不采用联立方程式而采用校正图的办法;对于发射光谱相互重叠的双组份或三组分荧光混合物的同时测定,在合适的条件下可应用类似于双波长分光度的原理,采用多波长荧光法进行测定。

上述这些办法提出时在当时的仪器条件下就是有效的、可以解决问题的,对拓宽荧光分析的应用范围就是发挥一定作用的,但毕竟方法比较繁琐、费时。

在目前的情况下,由于荧光分析在法学与仪器方面都有了很大的发展,就不必采用上述几种方法,而可以采用更为先进的方法,诸如本书后面将要介绍的同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定等方法,以及化学计量学的方法,来达到分别测定或同时测定的目的。

与常规荧光分析法相比,同步荧光分析法具有简化谱图、提高选择性、减少光散射干扰等特点,尤其适合多组分混合物的分析。

同步荧光扫描技术由Lloyd[13]首先提出,它与常用的荧光测定方法最大的区别就是同时扫描激发与发射两个单色器波长,由测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图,称为同步荧光光谱[14]。

根据激发与发射两种波长在同时扫描过程中彼此间所保持的关系,同步荧光分析法可分为如下四种类型:

第一种类型在同时扫描过程中使激发波长（

常数）,这种方法称为恒（固定）波长同步荧光分析法（constant-wavelengthsynchronousfluorescencespectrometry,CWSFS）,即习惯上所说的同步荧光法,就是最早提出的一种同步扫描技术[13-17];第二种类型则以能量关系代替波长关系,在两个单色器同时扫描过程中使激发波长与发射波长之间保持固定的能量差,这种方法称为恒能量同步荧光分析法（constant-energysynchronousfluorescencespectrometry,CESFS）[18-20];第三种类型称为可变角（或可变波长）同步荧光法（variable-anglesynchronousfluorescencespectrometry,MISFS）,其扫描路径表现为基体（将干扰物视为基体）的等荧光强度线。

同步荧光扫描测定具有如下优点:

1简化光谱;2窄化谱带;3减小光谱的重叠现象;4减小散射光的影响。

三维荧光光谱就是近几十年中发展起来的一种新的荧光分析技术。

这种技术区别于普通的荧光分析的主要特点在于它能获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息。

普通荧光分析所测得的光谱就是二维谱图,包括固定激发波长而扫描发射（即荧光测定）波长所获得的发射光谱,与固定发射波长而扫描激发波长所获得的激发光谱。

但就是,实际上荧光强度应就是激发与发射这两个波长变量的函数。

描述荧光强度同时随激发波长与发射波长变化的关系图谱,即为三维荧光光谱[21-27]。

另外,荧光分析法还有时间分辨与相分辨荧光分析法、荧光偏振测定、低温荧光分析法、固体表面荧光分析法、动力学荧光分析法空间分辨荧光分析技术、单分子荧光检测、荧光免疫分析法与导数荧光分析法。

固体表面荧光测有两种方法:

一种就是直接测定固体物质表面的荧光;另一种就是将待测组分吸附在固体物质表面,然后进行荧光测定。

才用的固体物质品种众多,有硅胶、氧化铝、滤纸、硅酮橡胶、乙酸钠、溴化钾、蔗糖、纤维素等。

固体表面荧光测定有两种不同形式,一为反射式,一为透射式。

采用反射式时,激发光源与荧光检测器同在样品的一边,一般互成45°角。

紫外激发光聚集于固体表面样品斑点上,样品发生的荧光经单色器散射后由检测器检测。

采用透射式时,一般将样品吸附在透明的薄层色谱板上,激发光源与检测器分处在样品的两边。

紫外激发光经滤光片除去可见光,聚集在样品斑点上而发可见光荧光,