临床化学常用分析技术.docx
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临床化学常用分析技术
本章考点
1.临床化学常用分析方法
2.临床化学方法的建立
第一节 临床化学常用分析方法
一、光谱分析（分光光度技术）
定义：
利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。
分类：
光谱分析技术分为发射光谱分析（荧光分析法和火焰光度法）、吸收光谱分析（可见及紫外光分光光度法、原子吸收分光光度法）和散射光谱分析（比浊法）。
（一）可见及紫外分光光度法
1.Beer定律：
A=k·b·c
k一吸光系数
b一光径，单位：
cm。
c一溶液浓度，单位：
g／L
2.摩尔吸光系数：
在公式“A=k·b·c”中，当c=1mol／L，b=lcm时，则常数k可用ε表示。
3.比吸光系数：
在公式“A=k·b·c”中，当c为百分浓度（w／v），b为cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。
（二）原子吸收分光光度法
原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术，常用的定量方法有：
1.标准曲线法：
将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。
在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。
由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。
2.标准加入法：
把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。
本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响。
3.内标法：
在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。
以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。
本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。
只适用于双通道型原子吸收分光光度计。
（三）荧光分析法
利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法。
在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称为发射光。
荧光分析法测定的是受光激发后所发射的荧光强弱。
（四）火焰光度法
火焰光度法是利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法。
样品中待测元素激发态原子的发射光强度I与该元素浓度C呈正比关系，即I=aC，式中a为常数，与样品组成、蒸发和激发过程有关。
火焰光度法通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。
（五）透射和散射光谱分析法
主要测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度，常用法为比浊法，又可称为透射比浊法和散射比浊法。
临床上多用于对抗原或抗体的定量分析。
二、电泳分析
在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。
常用的电泳分析方法：
1.醋酸纤维素薄膜电泳：
醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。
这种薄膜对蛋白质吸附小，能消除电泳中出现的“托尾”现象。
具有分离速度快、样品用量小的特点。
适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
2.凝胶电泳：
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子核酸。
琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。
3.等电聚焦电泳：
等电聚焦是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，在区带电泳中分辨率最好。
常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。
4.毛细管电泳：
利用电泳和电渗流的电动力学原理，在一种空芯的微小内径的毛细管中进行混合物的高效分离技术。
毛细管电泳可分为：
毛细管自由溶液区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳及胶束毛细管电动力学色谱。
三、离心技术
（一）离心技术的基本原理
离心技术是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同，用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。
离心技术分为制备离心技术和分析离心技术。
制备离心技术主要用于物质的分离、纯化，而分析离心技术主要用来分析样品的组成。
离心力（Fc）Fc=mω2X，m是质量（g），ω是旋转角速度（弧度／s）；X是颗粒离开旋转中心的距离（cm）。
相对离心力（RCF）：
RCF=1.118×lO-5·n·X，n为转子的转数（rpm）；X为离心转子的半径距离（cm）。
（二）离心技术种类及在检验中的应用
离心技术在生化检验中的应用主要有两方面：
①对悬浮液中颗粒的分离，如从全血中分离血清、血浆等；
②分离两种密度不同液相，如从有机溶剂和水的混合物中分离出有机相等。
1.普通离心法：
可用来分离细胞、细胞膜或细胞碎片。
2.差速离心法：
又称差级离心法，其原理是交替使用低速或高速离心，也可采用逐渐增加离心速度的办法，通过不断增加相对离心力使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。
由于分辨率不高，常用于定性分离手段之前的粗制品提取。
3.密度梯度离心法：
比差速离心法复杂，但该法具有很高的分辨率，可以同时使样品中的各个组分得到分离。
其做法是将样品放在密度梯度介质中进行离心。
可分为：
1）速率区带离心法：
根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。
离心前在离心管内装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。
离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大。
一般用于分离大小相异而密度相同的物质。
2）等密度区带离心法：
离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶部或与梯度液混合，当梯度液由于离心力作用逐渐形成低浓度而管顶稀的密度梯度，同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。
当管底介质的密度大于粒子的密度时，粒子上浮。
此法常用于分离大小相似而密度差异较大的物质。
4.分析性超速离心
主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，如测定大分子的相对分子量、生物大分子的纯度估计、分析生物大分子中的构象变化等。
四、层析技术
（一）层析技术的原理
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：
一是固定相，另一是流动相。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
（二）层析法分类
而按层析原理还可将层析分为：
1.凝胶层析：
又称分子筛过滤或排阻层析等。
固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度也不同。
本法的优点是所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。
常用的凝胶有SephadexG系列。
凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。
液体
气体
液体
固体
液-液层析
液-固层析
气-液层析
气-固层析
2.离子交换层析：
采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
3.高效液相层析（HPLC）：
在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。
具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利，根据流动相和固定相相对极性，高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。
4.亲和层析：
利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：
抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
五、电化学分析技术
（一）基本原理
利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。
通过测定原电池电动势以求物质含量的分析方法称为电位法；通过对电阻的测定以求物质含量的分析法称电导法；借助物理量的突变作为滴定分析终点的指示，则称为电容量分析法。
（二）离子选择性电极分析法
用离子选择电极直接电位法测定离子浓度，是临床实验室中不可缺少的检测手段，常被用于多种体液（血、尿、唾液、脑脊液等）中Ca2+、K+、Na+、Cl-、F-和碳酸氢盐等离子测定。
使用离子选择性电极电位分析法测定的是离子活度a，而一般分析中要求测定的是离子浓度c，二者关系为：
a=f·c，其中f为活度系数。
当稀溶液中活度系数f≈l时，a=c，活度可代表浓度。
高浓度测定时，通常在标准溶液和样品溶液中分别加入浓度很大的对待测离子无干扰的电解质，作为总离子强度调节缓冲剂，使标准溶液与待测溶液离子强度达到一致，并有缓冲及消除干扰的作用。
习题
下列何种方法可用于获得某种纯蛋白质（ ）
A.琼脂糖凝胶电泳 B.透析 C.离子交换层析 D.免疫固定电泳 E.亲和层析
『正确答案』E
发射光谱分析法是下列哪类测定法的原理（ ）
A.火焰光度法 B.离子选择性电极法 C.化学比色法 D.免疫法 E.放射免疫法
『正确答案』A
第二节 实验方法的选择
生物化学检验是利用各种检测技术和方法，研究人体组织、体液的各种成分及其含量，为临床疾病预防、疾病诊断、病情监测、疗效评价、预后判断提供准确可靠的信息。
选择准确可靠的实验方法是提供准确可靠信息的重要中心环节之一。
一、实验方法选择的目的
实验方法选择的根本目的：
①各实验室按照方法选择的原则结合自身条件，确定合适的某项目的检测方法。
②保证拟使用的检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法分析性能及可能引入的误差进行了解，作出初步评估。
二、实验方法的分级
在临床生化检验方面，检测项目和测定方法繁多，并且新项目、新方法不断涌现。
国际临床化学联合会（IFCC）根据分析方法的准确性与精密度的不同，将其分为决定性方法、参考方法和常规方法三级。
（一）决定性方法
决定性方法（definitivemethod）准确度最高，系统误差最小；经过详细研究未发现产生误差的原因，其测定结果与“真值”最为接近。
主要方法有重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）等。
由于技术要求太高，费用昂贵，因而这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于评价参考方法与一级标准品。
国际上研究这类方法的实验室很少，美国、法国、德国、丹麦等国家有这类实验室。
（二）参考方法
参考方法（referencemethod）是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。
这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。
参考方法能在条件优越的实验室作常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。
（三）常规方法
常规方法（routinemethod）应具有足够的精密度、准确度和特异度，有适当的分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目的的需要。
其中准确度已经确定即已查明偏差方向和数量的方法称为偏差已知方法，而准确度不明者称为偏离未知方法。
常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。
三、标准试剂的分级
标准试剂（即标准品）有许多名称，仍未统一。
国际标准化委员给标准品（参考物，referencematerial）作的定义为：
它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，可用以校正仪器和某种测定方法的物质。
标准品是进行方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制等不可缺少的，在临床化学中将其分为三级。
（一）一级标准品（原级参考物）
它是已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经定量。
一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（WBS）颁发证书，并指明其性质和有关数据。
一级标准品用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。
（二）二级标准品（次级参考物）
这类标准品可以是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），也可以存在于相似基质中。
可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。
二级标准品主要用于常规方法的标化和控制物的定值。
（三）控制物
控制物用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。
有定值血清和未定值血清两种。
控制物不能用于标定仪器或方法。
在控制物的制备、定值和使用过程中，应严格按有关规程进行。
四、实验方法选择的原则
实验方法选择要从实际出发，根据实验室的条件和检测要求确定适当的方法。
条件优越的实验室应建立和选择参考方法，以利于对常规方法的评价和标准品的定值；一般临床化学实验室应结合仪器设备、技术力量、实验成本等因素，主要选择常规分析方法和使用方便的参考方法。
选择常规分析方法时，尽量选用国内外通用方法或推荐方法，便于方法的规范化和质量控制，要重点考虑实用性和可靠性两方面的性能指标。
（一）实用性
1.微量快速便于急诊，适合批量成套分析。
快速即检测速度，是指一份标本操作一次所需时间以及在常规条件下单位时间（小时、天）内所能处理的标本数量。
2.方法简便操作人员无需特殊培训；试剂种类少，最好是单一试剂，易于自动化分析。
3.安全可靠试剂无毒，腐蚀性小，无需特殊防护措施。
4.成本低廉无需昂贵试剂和仪器，每件成本费用与一次分析的标本数量有关，应区别单件标本及不同工作量时的费用。
（二）可靠性
所选方法应具有较高的精密度、准确度和较大的检测能力，保证测定结果的准确性能满足方法允许误差限度的要求。
五、实验方法选择的步骤
（一）广泛查阅文献
广泛查阅已发表的相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，仔细分析方法特点。
（二）选定候选方法
根据实验室的设备条件、人员业务素质、工作量等具体情况，选择适合于本实验室具体条件的方法（候选方法）。
候选方法确定后，应写出该法的原理、参考文献、所用仪器、试剂来源和纯度、标本收集要求、详细的操作步骤、结果计算和分析、参考范围、注意事项等。
（三）候选方法的初步试验
对候选方法应作初步评价实验。
初步试验包括：
①标准曲线和重复性；②质控血清和新鲜标本的重复试验；③分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。
通过对候选方法的初步实验使工作者熟悉有关技术，掌握各分析步骤要点，判断能否适合本室条件要求。
根据初试所获得的资料确定是否有必要作进一步研究。
第三节 实验方法的评价
候选方法经过初步实验作出符合实验要求的判断后，就需要对该方法进行系统评价。
实验方法评价的过程就是对实验误差的测定。
根据评价实验所测得的结果和方法性能判断的标准，决定该方法是否可以被接受。
一、实验误差
实验误差（简称误差）是量值的给出值与其客观真值之差。
给出值包括测量值、标称值等，具有广泛性。
标本中待测物的真实浓度为真值，它是客观存在的，但在有限次的测定中，不可能求得真值；在实际工作中，采用严格的实验条件和最准确精密的方法，多次重复测定所得的测定值的平均值代表相对意义的真值。
（一）实验误差的分类
按照来源性质，实验误差可被分为系统误差、随机误差二类。
1.系统误差系统误差（systematicerror，SE）是指一系列测定值对真值存在同一倾向的偏差。
具有单向性，而没有随机性，常有一定的大小和方向；一般由恒定的因素引起，并在一定条件下多次测定中重复出现。
找到引起误差的原因，采取一定措施即可纠正。
消除系统误差能提高测定的准确度。
系统误差可分为恒定系统误差（constanterror，CE）和比例系统误差（proportionalerror，PE）。
前者是指由干扰物引起的使测定值与真值存在恒定大小的误差，误差大小与被测物浓度无关，而与干扰物浓度相关。
后者是指相对于被测物浓度有相同的百分比误差，误差的绝对量与被测物浓度成正比。
引起系统误差主要原因有：
①方法误差。
这是生化检验中最严重、最难避免的误差，是由方法的分析性能固有的缺陷所致，如特异度不高、标本中干扰物的存在等。
可以通过方法的选择和评价，减小误差。
②仪器和试剂误差。
常见于仪器波长未校准，量器不准，试剂质量差等。
2.随机误差。
随机误差（randomerror，RE）是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时引起的误差。
误差没有一定的大小和方向，可正可负，数据呈正态分布；具有不可预测性，不可避免，但可控制在一定范围内；分析步骤越多，造成这种误差的机会越多；随测定次数增加，其算术均数就越接近于真值。
随机误差是由测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变以及分析人员操作习惯等因素的变化而引起。
引起随机误差和系统误差的原因是相对的，有时引起系统误差的因素可以引起随机误差，引起随机误差的因素也可引起系统误差，随机误差和系统误差在一定条件下能相互转化。
（二）实验误差的表示方法
因误差性质不同，实验误差采用不同的表示方法，主要有以下几种：
1.平均误差：
平均误差是指一组测定值中，测定值与均值之差的平均值，
2.标准偏差（标准差）：
标准偏差是方差（S2）的平方根值，用S表示。
它是表示精密度的较好的指标。
标准差的单位和原始数据相同，测定次数一般要求在10次以上。
3.绝对误差和绝对偏差：
绝对误差指测定值与真值间的差值，即绝对误差=测定值（X）-真值（T）。
绝对误差有正值和负值。
测定值与测定均值间的差异称为绝对偏差，即绝对偏差=测定值（X）-测定均值（
）。
绝对误差、绝对偏差表示误差绝对值的大小，无法比较测定误差之间的大小。
4.相对误差和相对偏差：
相对误差为绝对误差与真值的百分比值，相对偏差为绝对偏差与测定均值的百分比值。
5.变异系数（coefficientofvariation，CV）：
CV是样本标准差与样本均数的百分比值,即
。
CV值用于比较各组数据间的变异情况，不受单位影响。
CV值越大,测定值离散度越大，精密度越差。
二、方法评价的基本内容和步骤
（一）方法评价的基本内容
方法评价的基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度和准确度。
在实验中实际测定的是不精密度与不准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。
方法学评价的各项实验是为检测各种类型的实验误差而设计的。
它们间的相互关系见表3-6。
（二）方法评价步骤
根据方法选择的要求确定某方法（候选方法），在使用前最好经本实验室进行评价实验，方法评价步骤如下：
1.评价前实验：
重点研究候选方法的最适条件。
最适条件包括试剂浓度、缓冲体系的种类、离子强度和pH值、反应温度和时间、样品体积分数、检测波长、方法线性范围等。
对文献报道的条件作必要的验证。
2.初步评价：
包括批内和日内重复性试验、回收试验、干扰试验。
3.最后评价：
依顺序作日间重复性试验，方法比较试验和总体判断方法是否可接受。
4.评价后实验：
如方法可接受，则进行临床相关研究，包括参考值确定和特殊病人标本的测定等。
5.方法应用：
建立质控系统，培训操作者，引入常规工作等。
方法评价是一项科学性强、方法严谨、费时耗力的工作，应将实验方法和结果进行科学的整理和总结。
三、方法评价指标
实验方法评价指标包括精密度、准确度、检测能力等。
（一）精密度
精密度（precision）是表示测定结果中随机误差大小程度的指标。
它表示同一标本在一定条件下多次重复测定所得到的一系列单次测定值的符合程度。
精密度自身无量度指标，常用标准差（S）或变异系数（CV%）表示。
值得注意的是使用标准差及变异系数时，应说明实验的重复次数及其均值。
1.连续测定的精密度在相同条件下，对同一标本连续进行n次重复测定结果的符合程度。
在有限次测定情况下，一般用σ（总体标准差）的估计值S（样本标准差）来表达这种精密度。
2.重复性精密度（repeatabilityprecision）又称室（批）内精密度，指在相同条件下（同样方法、同一种试剂和标准品、同样仪器、在同一实验室由同一人操作，并要保持实验期间准确性不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮n次重复测定结果之间相互接近的程度。
3.再现性精密度（reproductivityprecision）又称室（批）间精密度，指在不同条件下（不同操作者，用不同仪器，在不同实验室和不同时间）采用同一方法对同一标本所获得的单次测定结果之间彼此符合程度。
再现性精密度既包括了不同操作者的误差，也包括了不同条件下的仪器误差，所以对检验方法的再现性作估计时，所要采用的方法比估计重复性更为复杂。
再现性精密度多用于实验室间的质量估计，其标准差常称为室间标准差。
室（批）间标准差，是在对室（批）间重复性试验结果进行单因素完全随机设计方差分析后进行计算。
（二）准确度
准确度（accuracy）是指测定结果与真值接近的程度，一般用偏差和偏差系数表示。
偏差为重复测定均值（
）与真值之差。
偏差系数（CB）=|真值-
|×100/真值。
要知道准确度首先要知道真值，但真值通常是不知道的。
在实际工作中，通常用已知含量的标准品来检查分析方法的系统误差，确定分析方法的准确度。
在没有标准品的场合，常用已确认的标准方法的测定结果作为标准值，来对照被检验方法是否存在系统误差，以确定准确度。
准确度主要受系统误差支配（系统误差愈小，准确度越高），也受随机误差的影响，所以准确度是表示测定结果中系统误差和随机误差的综合。
公式表示为：
A=Σ+△a。
式中A表示准确度，Σ表示已定系统误差的综合，△a表示在显著性水平为a时，未定系统误差和随机误差合并后的不确定度。
不确定度（uncer
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