植物试验技术课件.docx
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植物试验技术课件
河南科技大学教案首页
课程名称
植物实验原理与方法
计划学时
32
授课章节
第一、二章 概述与取样方法
教学目的和要求：
1、使学生掌握衡量作物生长发育状况的指标体系；
2、掌握作物产量与品质形成特点的指标体系；
3、了解和掌握测定其指标的样品的选取方法与技巧以及其具体的测定原理与方法。
教学基本内容：
1、与作物生长发育相关指标体系、与产量和品质形成的相关指标以及分析这些指标的意义。
2、代表性实验样品的选取要求，代表性植株样品（干样与鲜样）的处理与保存，室内试材的一般培养。
教学重点和难点：
1、正确理解指标体系的意义
2、理解把握选取代表性的样品，科学采集、保存试验样品
授课方式、方法和手段：
以板书为主，结合学生以前所学，重点讲述样品的选取方法与技巧以及其具体的测定原理与方法。
作业与思考题：
1、如何准确、科学采集、保存试验样品?
2、作物群体质量的内容？
植物实验原理与方法是农学专业的一门专业基础选修课。
主要内容包括作物生长发育规律、生理生化、营养品质及营养元素等相关指标的测定原理与方法。
通过本课程的学习，要求我们学生掌握衡量作物生长发育状况、产量形成特点及品质形成特点等相关指标测定原理与方法，从而提高学生综合科研实践技能。
第一章、概述
对于实验原理的掌握是我们正确理解实验本身的意义的基础，正确的采集和处理样品是实验精确的前提，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。
对于概述我们要重点掌握群体质量指标。
一、抽穗至成熟期群体光合是衡量作物群体质量的核心指标
光合作用是产量的源泉，光于光合作用与产量的关系，尼契波若维奇提出了著名的公式：
经济产量=生物产量×经济系数，提出了生物产量与经济产量的概念，强调生物产量是经济产量的基础，但是怎样提高经济系数？
没有阐述清楚。
产量的来源有两个部分，一是抽穗前储藏在茎鞘中的非结构性碳水化合物，另外就是光合产物。
2、足够的颖花量是群体的主要经济质量指标
增加单位面积上的总颖花数是高产的基础，增加总颖花量对后期物质生产的促进。
3、在群体适宜叶面积范围内，粒，叶（cm：
）是衡量库、源关系和群体光合生产力的一个综
合指标
叶是光合物质生产源，但其增长毕竟有限度，越大会有多种弊端，恶化群体质量。
为此，在稳定高产最适叶面积的情况下，要尽可能多地提高总颖花量，就产生了必须提高粒（颖花）与叶面积（cm：
1比的问题。
只有将LAI调节或矫正到适宜范围时形成高粒／叶与高颖花量，才能库大源强，二者调．使群体具有更高产的潜力，同时，分析颖花的消光情况可知，控制住最适叶而积，提高粒及总颖花量，增强抽穗至成熟期群体光合生产力的根本途径，是高产群体质量的最重要特征。
4、有效及高效叶面积率对高产群体质量，生理特性的外在表述意义
提高群体内的有效叶面积量【指有效茎蘖的绿叶面积量）．充分发挥其光台功能．减少无效叶量，减轻它们恶化群体的不良作用，是高光效群体质量的一个重要生理外表指标孕穗期的群体最大叶面积由有效茎蘖和无效茎蘖两部分叶构成，无效分蘖会降低群体粒／叶（era），对群体弊多益少。
在有效茎蘖上，由上部3片高效能与F部低敏能的两组叶片组成。
增加有效叶而积的科学含义在抽穗前，一是通过控制无效分蘖的发生来增加有效叶而积及其百分率：
二是在保持单茎具有和伸长节问数相等的绿色叶片数的要求下。
尽可能地提高上部3张高效能叶片叶面积的百分率。
这3张叶的叶而积百分率高，抽穗后并能延长寿命，即可提高群体粒／叶（crl3），提高抽穗至成熟期的光合生产力。
5、颖花根活量在群体质量中的意义
在根群构成及根系活力与地上部生理关系方面已有研究，在此基础上进一步探讨的结果表明，颖花根活量是抽穗至成熟期根系对群体质量的最好表述指标将水稻结实期根活量（根量与活力的乘积）的平均值与颖花量的比值称作颖花根活量，联系水稻后期生产力的有关指标进行分析，结果发现两者之间关系甚为密切。
在每亩具有足够的总颖花量前提下，水稻具有较高的颖花根活量，实质上是“库大“源强，且二者相协调的重要标志。
其与前述的粒叶比（mg／cm）呈极显著正相关，夫田人样本调查亦表明，颖花根活量大，叶片厚【比叶重与颖花根活量的相关系数为，粒叶比也高。
因此在生产实践中为了方便诊断，粒叶比也可作为颖花根活量大小的综合指标。
笔者等对杂交水稻汕优63根系活性与籽粒结实关系的研究表明，颖花根活量高的水稻具有诸多的优势。
6、较高的成穗率与适宜穗数对群体质量的意义
水稻群体由有效分蘖和无效分蘖组成。
控制群体的最高总茎蘖数，尽量减少无效分蘖，尽可能多地提高成穗率，提高有效分蘖的比例，是全面提高群体质量的一项最直观，易诊断掌握的综合性指标。
因为提高有效分蘖比例是提高总颖花量和有效叶面积比例，达到提高粒叶（cnl）的一个直接因素。
控制无效分蘖，必然会同时控制有效茎基部叶片生长，为提高上部高效叶面积比例奠定基础。
无效蘖减少，茎基部叶片适当变小，改善了中后期群体的光照条件，可促进上部高效叶生长，相伴的是大穗的形成和单茎茎鞘重的增加，以及颖花根活量的提高。
最终结果是：
提高抽穗期的粒叶比，增加总颖花数，提高后期光合生产能力和产量因此，提高有效分蘖率（成穗率）、单位面积上形成适宜的穗数，足高产群体苗、株、穗、粒合理发展的综合性指标。
表3水稻超高产群体指标
Table3Populationindexesofsuperhigh-yieldingrice
项目Item
指标Index
总颖花量Totalspikelets（×104·m-2）
>4.5
结实率Filled-grainpercentage（%）
>90
千粒重1000-grainweight（g）
26~28
分蘖成穗率Theratioofproductivetillerstototaltillers（%）
>80
抽穗期叶面积指数Leafareaindexatheading
7.5~8
总光合势Totalphotosyntheticpotential（m2·d·hm-2）
>5×106
成熟期干物质重Drymatterweightatmaturity（t·hm-2）
>22
抽穗至成熟干物质重Drymatterweightfromheadingtomaturity（t·hm-2）
>8
粒叶比Grain-leafratio（Noofspikeletsper1cm2leafarea）
>0.58
茎鞘物质运转率Translocationratioofmatterfromstemsandsheaths（%）
>11
抽穗期根冠比Root-shootratioatheading
>0.25
抽穗期根系伤流量Rootexudatesatheading（g·m-2·h-1）
>5
收获指数Harvestindex
>0.51
第二章、植物材料的采集、处理与保存
植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。
在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。
因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。
一、植物材料的采集
植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。
所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。
目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。
在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。
除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。
采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。
除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
为了保证植物材料的代表性，必须运用科学方法采取材料。
从大田或实验地、实验器皿中采取的植物材料，称为“原始样品”，再按原始样品的种类（如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等）分别选出“平均样品”，然后根据分析的目的、要求和样品种类的特征，采用适当的方法，从“平均样品”中选出供分析用的“分析样品”。
（一）原始样品的取样法
1.随机取样
在试验区（或大田）中选择有代表性的取样点，取样点的数目视田块的大小而定。
选好点后，随机采取一定数量的样株，或在每一个取样点上按规定的面积从中采取样株。
2.对角线取样
在试验区（或大田）可按对角线选定五个取样点，然后在每个点上随机取一定数量的样株，或在每个取样点上按规定的面积从中采取样株。
（二）平均样品的取样法
1.混合取样法
一般颗粒状（如种子等）或已碾磨成粉末状的样品可以采取混合取样法进行。
具体的做法为：
将供采取样品的材料铺在木板（或玻璃板、牛皮纸）上成为均匀的一层，按照对角线划分为四等分。
取对角的两份为进一步取样的材料，而将其余的对角两份淘汰。
再将已取中的两份样品充分混合后重复上述方法取样。
反复操作，每次均淘汰50％的样品，直至所取样品达到所要求的数量为止。
这种取样的方法叫做“四分法”。
一般禾谷类、豆类及油料作物的种子均可采用这个方法采取平均样品，但注意样品中不要混有不成熟的种子及其他混杂物。
2.按比例取样法
有些作物、果品等材料，在生长不均等的情况下，应将原始样品按不同类型的比例选取平均样品。
例如对甘薯、甜菜、马铃薯等块根、块茎材料选取平均样品时，应按大、中、小不同类型的样品的比例取样，然后再将每一单个样品纵切剖开，每个切取1/4、1/8或1/16，混在一起组成平均样品。
在采取果实的平均样品时，如桃、梨、苹果、柑橘等果实，即使是从同一株果树上取样，也应考虑到果枝在树冠上的各个不同方位和部位以及果实体积的大、中、小和成熟度上的差异，按各自相关的比例取样，再混合成平均样品。
（三）取样注意事项
1.取样的地点，一般在距田埂或地边一定距离的株行取样，或在特定的取样区内取样。
取样点的四周不应该有缺株的现象。
2.取样后，按分析的目的分成各部分（如根、茎、叶、果等），然后捆齐，并附上标签，装入纸袋。
有些多汁果实取样时，应用锋利的不锈钢刀剖切，并注意勿使果汁流失。
3.对于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等样品，因含水分较多，容易变质或霉烂，可以在冰箱中冷藏，或进行灭菌处理或烘干以供分析之用。
4.选取平均样品的数量应当不少于供分析用样品的两倍。
5.为了动态地了解供试验用的植物在不同生育期的生理状况，常按植物不同的生育期采取样品进行分析。
取样方法系在植物的不同生育时期先调查植株的生育状况并区分为若干类型，计算出各种类型植株所占的百分比，再按此比例采取相应数目的样株作为平均样品。
二、分析样品的处理和保存
1．从田间采取的植株样品，或是从植株上采取的器官组织样品，在正式测定之前的一段时间里，如何正确妥善的保存和处理是很重要的，它也关系到测定结果的准确性。
一般测定中，所取植株样品应该是生育正常无损伤的健康材料。
取下的植株样品或器官组织样品，必须放入事先准备好的保湿容器中，以维持试样的水分状况和未取下之前基本一致。
否则，由于取样后的失水，特别是在田间取样带回室内的过程中，由于强烈失水，使离体材料的许多生理过程发生明显的变化，用这样的试材进行测定，就不可能得到正确可靠的结果。
为了保持正常的水分状况，在剪取植株样品后，应立即插入有水的桶中，对于枝条，还应该立即在水中进行第二次剪切，即将第一次切口上方的一段在水中剪去，以防输导组织中水柱被拉断，影响正常的水分运输。
对于器官组织样品，如叶片或叶组织，在取样后就应立即放入已铺有湿纱布带盖的瓷盘中，或铺有湿滤纸的培养皿中。
对于干旱研究的有关试材，应尽可能维持其原来的水分状况。
采回的新鲜样品（平均样品）在做分析之前，一般先要经过净化、杀青、烘干（或风干）等一系列处理。
（1）净化新鲜样品从田间或试验地取回时，常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦净，不应用水冲洗。
（2）杀青为了保持样品化学成分不发生转变和损耗，应将样品置于105℃的烘箱中烘15min以终止样品中酶的活动。
（3）烘干样品经过杀青之后，应立即降低烘箱的温度，维持在70～80℃，直到烘至恒重。
烘干所需的时间因样品数量和含水量、烘箱的容积和通风性能而定。
在无烘箱的条件下，也可将样品置蒸笼中以蒸汽杀青，而后于阴凉通风处风干。
但在蒸汽杀青过程中，常有可溶性物质的外渗损失，因此，此法仅可作为测量大量样品干重时的变通方法，在进行成分分析时应尽量避免。
烘干时应注意温度不可过高，否则会把样品烤焦，特别是含糖较多的样品，更易在高温下焦化。
为了更精密地分析，避免某些成分的损失（如蛋白质、维生素、糖等），在条件许可的情况下最好采用真空干燥法。
此外，在测定植物材料中酶的活性或某些成分（如维生素C、DNA、RNA等）的含量时，需要用新鲜样品。
取样时注意保鲜，取样后应立即进行待测组分提取；也可采用液氮中冷冻保存或冰冻真空干燥法得到干燥的制品。
放在0～4℃冰箱中保存即可。
在鲜样已进行了匀浆，尚未完成提取、纯化，不能进行分析测定等特殊情况下，也可加入防腐剂（甲苯、苯甲酸），以液态保存在缓冲液中，置于0～4℃冰箱即可。
但保存时间不宜过长。
2．已经烘干（或风干）的样品，可根据样品的种类、特点进行以下处理：
（1）种子样品的处理一般种子（如禾谷类种子）的平均样品清除杂质后要进行磨碎，在磨碎样品前后都应彻底清除磨粉机（或其他碾磨用具）内部的残留物，以免不同样品之间的机械混杂，也可将最初磨出的少量样品弃去，然后正式磨碎，最后使样品全部无损地通过1mm筛孔的筛子，混合均匀作为分析样品贮存于具有磨口玻塞的广口瓶中，贴上标签，注明样品的采取地点、试验处理、采样日期和采样人姓名等。
长期保存的样品，贮存瓶上的标签还需要涂蜡。
为防止样品在贮存期间生虫，可在瓶中放置一点樟脑或对位二氯甲苯。
对于油料作物种子（如芝麻、亚麻、花生、蓖麻等）需要测定其含油量时，不应当用磨粉机磨碎，否则样品中所含的油分吸附在磨粉机上将明显地影响分析的准确性。
所以，对于油料种子应将少量样品放在研钵内研碎或用切片机切成薄片作为分析样品。
（2）茎秆样品的处理烘干（或风干）的茎秆样品，均要进行磨碎，磨茎秆用的电磨与磨种子的磨粉机结构不同，不宜用磨种子的电磨来磨碎茎秆。
如果茎秆样品的含水量偏高而不利于磨碎时，应进一步烘干后再进行磨碎。
（3）多汁样品的处理柔嫩多汁样品（如浆果、瓜、菜、块根、块茎、球茎等）的成分（如蛋白质、可溶性糖、维生素、色素等）很容易发生代谢变化和损失，因此常用其新鲜样品直接进行各项测定及分析。
一般应将新鲜的平均样品切成小块，置于电动捣碎机的玻璃缸内进行捣碎。
若样品含水量不够（如甜菜、甘薯等）可以根据样品重加入0.1～1倍的蒸馏水。
充分捣碎后的样品应成浆状，从中取出混合均匀的样品进行分析。
如果不能及时分析，最好不要急于将其捣碎，以免其中化学成分发生变化而难以准确测定。
在进行新鲜材料的活性成分（如酶活性）测定时，样品的匀浆、研磨一定要在冰浴上或低温室内操作。
新鲜样品采后来不及测定的，可放入液氮中速冻，再放入﹣70℃冰箱中保存。
供试样品一般应该在暗处保存，但是，对于供光合、蒸腾、气孔阻力等的测定样品，在光下保存更为合理。
一般可将这些供试样品保存在室内光强下，但从测定前的0.5～1.0小时开始，应对这些材料进行测定前的光照预处理，也叫光照前处理。
这不仅是为了使气孔能正常开放，也是为了使一些光合酶类能预先被激活，以便在测定时能获得正常水平的值，而且还能缩短测定时间。
光照前处理的光强，一般应和测定时的光照条件一致。
测定材料在取样后，一般应在当天测定使用，不应该过夜保存。
需要过夜时，也应在较低温度下保存，但在测定前应使材料温度恢复到测定条件的温度。
对于采集的籽粒样品，在剔除杂质和破损籽粒后，一般可用风干法进行干燥。
但有时根据研究的要求，也可立即烘干。
对叶片等组织样品，在取样后则应立即烘干。
为了加速烘干，对于茎秆、果穗等器官组织应事先切成细条或碎块。
附：
经常用的测定方法
植物体内硝酸还原酶活性测定
硝酸还原酶（nitratereductase）是植物体内氮素同化的关键酶，它催化植物体内硝酸盐还原为亚硝酸盐。
产生的亚硝酸盐与对－氨基苯磺酸及α－萘胺在酸性条件下生成红色偶氮化合物。
其反应如下：
生成的红色偶氮化合物在波长540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计进行测定。
硝酸还原酶活性由产生的NO2-1量来表示。
（
）
一、材料、仪器及试剂
（一）材料
小麦叶片
（二）仪器
冷冻离心机，分光光度计，天平，冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，试管（带塞），移液管，洗耳球。
（三）试剂
1.亚硝酸钠标准液：
准确称取NaNO20.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮的1μg/ml的标准液。
2.0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液。
Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O2.4965g加无离子水溶解后定容至l000ml。
3.l％磺胺溶液。
1.0g磺胺溶于100ml3mol/lHCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/lHCL）。
4.0.02％α-萘胺溶液。
0.02gα-萘胺溶于100ml无离子水中，贮于棕色瓶中。
5.0.1mol/lKNO3溶液。
2.5275gKNO3溶于250m10.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液。
6.0.025mol/lpH8.7的磷酸缓冲液。
8.864gNa2HPO4.12H2O，0.057gK2HPO4.3H2O溶于1000ml无离子水中。
7.提取缓冲液。
0.1211g半胱氨酸、0.0372gEDTA溶于100ml0.025mol/lpH8.7的磷酸缓冲液中。
8.2mg/mlNADH溶液。
2mgNADH溶于lml0.1mol/lpH7.5磷酸缓冲液中（临用前配制）。
二、实验步骤
（一）标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表2－9－l顺序加人试剂，配成0－2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），吸光度值为纵坐标（y）建立回归方程。
（二）样品中硝酸还原酶活力测定
1.酶的提取
称取0.3g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。
2.酶的反应
取粗酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml0.1mol/lKNO3磷酸缓冲液和0.4mlNADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml0.1mol/lpH7.5磷酸缓冲液代替。
3.终止反应和比色测定
保温结束后立即加人lml磺胺溶液终止酶反应，再加1mlα-萘胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。
4．根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（μg）。
表2－9－1配制标准溶液时的各物质加入量
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液/ml
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水/ml
2.0
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0
1%磺胺/ml
4
4
4
4
4
4
4
0.02%α-萘胺
4
4
4
4
4
4
4
每管含亚硝氮/μg
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
三、结果计算
单位鲜重样品中硝酸还原酶活性
[μg/（g.h）]
式中：
为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg；V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；V2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；W为样品鲜重，g；t为反应时间，h。
实验二、脯氨酸含量的测定
1.原理：
磺基水杨酸对脯氨酸有特定的反应。
当用磺基水杨酸溶液处理植物样品时，脯氨酸便溶于其中。
然后加酸性茚三酮，加热，则溶液成红色反应。
再用甲苯萃取，则红色物质全部转移至甲苯中。
红色的深浅与脯氨酸含量相关。
在520nm波长下进行比色。
根据标准曲线查出的值即可计算出样品中脯氨酸的含量。
2.药品：
（1）标准曲线配制：
称取10mg脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸馏水定容至100ml容量瓶内，浓度为100ug/ml。
其为母液。
容量瓶号（50ml）
1
2
3
4
5
6
7
取母液（ml）
0.0
0.5
1.0
2.5
5.0
7.5
10.0
用水定容到50ml
试管号
1
2
3
4
5
6
7
取对应配好标液（ml）
2
2
2
2
2
2
2
各试管加2ml冰醋酸
各试管加4ml酸性茚三酮
各试管加3%磺基水杨酸2ml
浓度（ug/ml）
0.0
1.0
2.5
5.0
10.0
15.0
20.0
沸水浴中加热显色60min，后冷却至室温，加4ml甲苯萃取，在520nm比色。
（2）2.5%酸性茚三酮：
2.5g茚三酮，加入60m冰醋酸和40ml6mol/L磷酸于70度下加热溶解，冷却后存于棕色试剂瓶4度2-3日有效。
（2）3%磺基水杨酸：
3g定容到100ml水中。
（3）6mol/L磷酸：
取41ml浓磷酸定容到100ml，即为6mol/L磷酸。
3.步骤称取去叶脉叶片0.5g左右，均匀剪碎，加5ml3%磺基水杨酸，加塞沸水浴10分钟，冷却4000rpm10分钟。
后取提取液2ml，分别加入2ml水、2ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮试剂，摇匀后沸水浴60min，冷却室温后加入4ml甲苯，充分振荡，以萃取红色产物，待完全分层后，吸取甲苯层，于分光光度计520nm测定。
注意事项：
酸性茚三酮试剂现配现用，脯氨酸与茚三酮试剂在100度下的反应时间要严格控制，不宜过久，否则会引起沉淀。
实验三、过氧化物酶、超氧化物岐化酶SOD活性及丙二醛含量的测定
一、原理
过氧化物酶：
在代谢中调控ZAA含量水平，免除机体内产生H2O2的毒害作用。
在过氧化氢存在下，过氧化氢酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色4-邻甲氧基苯酚。
用分光光度计测量生成物的含量。
SOD酶：
能消除逆境生理生成的氧自由基作用。
氮基四唑在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后能发生光化还原反应
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