纳米金修饰电极和探针载体的DNA电化学发光分析方法研究精.docx

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纳米金修饰电极和探针载体的DNA电化学发光分析方法研究精

收稿日期:

2005-10-12

基金项目:

国家自然科学基金资助项目（20375025

作者简介:

王辉,男,硕士,主要从事电化学发光生物传感器方面的研究.*通讯作者:

张成孝,男,教授,博士研究生导师.

文章编号:

1672-4291（200604-0069-04

纳米金修饰电极和探针载体的DNA

电化学发光分析方法研究

王辉,李延,漆红兰,张成孝*

（陕西师范大学化学与材料科学学院,陕西西安710062

摘要:

提出以纳米金修饰电极和以纳米金粒子作DNA探针载体的电化学发光检测DNA新方法.首先将纳米金自组装在金电极上,再将含巯基的目标ss-DNA固定于纳米金修饰的电极上,然后与以纳米金粒子作载体的电化学发光DNA探针进行杂交反应,将此电极做工作电极,在含有三丙胺的溶液中进行电化学发光测量.在选定实验条件下,检测囊肿纤维DNA片断（20base的线性范围为1.0@10-12~1.0@10-9mol/L,相关系数为0.9954,检出限为5.0@10-13mol/L.实验结果表明,纳米金具有较大的比表面积,可增强DNA在电极上的固定量,从而增强电化学发光检测信号,提高方法的灵敏度.

关键词:

核酸分析;金纳米粒子;电化学发光中图分类号:

O657.3;Q5文献标识码:

A

ElectrogeneratedchemiluminesencedetectionforDNAhybridizationbasedongoldnanoparticlesaselectrode-modified

materialsandcarryingmultipleprobes

WANGHui,LIYan,QIHong-lan,ZHANGCheng-xiao*

（CollegeofChemistryandMaterialsScience,

ShaanxiNormalUniversity,Xican710062,Shaanxi,China

Abstract:

Anovelsensitiveelectrogeneratedchemiluminescence（ECLmethodforthedetectionDNAhybridizationwasdeveloped.Goldnanoparticleswereusedasbothelectrode-modifiedmaterialsandacarrieroftheECLprobe.Itwasfoundthatthesensitivitywasgreatlyenhancedatelectrodemodifiedbysel-fassembledgoldnanoparticlesduetotheenlargementoftheelectrodesurfaceareaandtheenhancementoftheimmobilizationamountoftargetDNAontheelectrode.TheintegratedECLintensitywasincreasedabout3.9-foldwhentheECLprobeofRu（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Auwasused.TheresultsshowedthattheintegratedECLintensitywaslinearlyrelatedtotheconcentrationoftargetDNAfrom1.0@10-12

mol/Lto1.0@10

-9

mol/Lwithadetectionlimitof5.0@10

-13

mol/L

targetENA.

Keywords:

DNA;goldnanoparticles;electrogeneratedchemiluminescence基因检测在卫生防疫、医学诊断、生物工程、环境科学及药物研制等领域都发挥着重要作用,提高

基因检测的灵敏度是基因检测方法研究的重要课题[1].文献[2]在金纳米上同时标记二茂铁和目标

第34卷第4期陕西师范大学学报（自然科学版

Vol.34No.42006年12月JournalofShaanxiNormalUniversity（NaturalScienceEditionDec.2006

DNA,然后通过伏安法测定目标DNA,检测限可达10-12mol/L.文献[3]利用纳米金标记的寡核苷酸探针与互补DNA杂交后,酸性条件下溶出金离子,利用阳极溶出伏安法检测金离子,间接检测DNA含量,检测限可达5@10-12

mol/L.我们以蛋白质BSA为载体,建立了多标记电化学发光免疫分析新

方法[4-5]

和以纳米金粒子为载体,建立了多标记电化学发光DNA杂交检测新方法[6].本文我们提出

将金纳米粒子自组装修饰电极与金纳米粒子为探针载体结合,以突变型囊肿纤维DNA片段为目标检测物,建立纳米金两次放大DNA电化学发光分析新方法,研究电化学发光信号增强的原因.

1试验部分

1.1仪器与试剂

RuCl3#xH2O（Sigma公司,牛血清白蛋白（BSA,华美生物有限公司,咪唑（西安宝信生物工程有限公司,CoCl3.xH2O和三丙胺（TPA（上海试剂一厂,1,6-己二硫醇（Fluka公司;10mmol/LTris-HCl（pH值为7.4,0.10mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS,pH值为714,011mol/LNaCl+10mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4.按照文献[7]合成Co（bpy3Cl2,纳米金胶体（直径约15nm,浓度为3.0@10-9mol/L[8]和以纳米金为载体的电化学发光探针Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au[6]（钌联吡啶的衍生物,bpy:

2,2c-联吡啶,dcbpy:

2,2c-吡啶-4,4c-二碳酸,NHS:

N-羟基琥珀酰胺.

人工合成两种不同序列的核苷酸片段（上海生物工程有限公司:

突变型囊肿纤维DNA（MutantType,MT:

5c-GAAACACCAATGATATTTTC-（CH23-HS-3c;

探针DNA:

5c-PO3-4-GAAAATATCATTGGTGTTTC-（CH23-HS-3c.

其他所用试剂均为分析纯,所用水为二次蒸馏水.

电化学系统为MEC12B型多功能伏安仪（江苏电分析仪器厂;发光测量系统为BPCL微光测量仪（中国科学院生物物理研究所,记录电化学发光强度（负高压为-1000V,0.5s记数1次,其中电解池的底部正对着光窗,置于暗室中.电极为三电极体系,工作电极为金电极（U=2mm,对极为铂片（4mm@5mm,参比电极为Ag/AgCl（饱和KCl电极.CHI660A电化学工作站（上海辰华仪器公司.1.2试验方法

O,超声清洗3min,在0.10mol/LH2SO4溶液中,0.2~1.5V范围扫描至得到稳定的循环伏安图.随后将经电化学处理后的金电极用二次水冲洗.在室温黑暗处,将处理好并洗净的金电极浸泡在0.1mol/L的经过除氧的1.6-己二硫醇水溶液中2h,制得1.6-己二硫醇修饰金电极,用水充分冲洗除去物理吸附的1.6-己二硫醇后,然后滴加50LL新制备的纳米金,在空气中晾干,得到纳米金/1.6-己二硫醇修饰金电极.

将纳米金/1.6-己二硫醇修饰电极被浸泡到含有0.50mL不同浓度的巯基修饰囊肿纤维DNA（MT片断的0.1mol/LPBS（pH值为7.4缓冲溶液中4h（40e,得到HS-ssDNA/纳米金/1.6-己二硫醇修饰金电极,将固定了目标DNA的金电极浸入含有探针Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au（浓度为:

5.0@10-8mol/L的0.10mol/LPBS（pH值为7.4溶液中,在40e恒温4h进行杂交反应,溶液保持均匀搅拌.取出电极用同样的缓冲溶液清洗三次电极,以除去吸附在电极表面的未杂交的DNA探针.

电化学发光测量在2.0mL含0.10mol/LTPA的0.10mol/LPBS（pH值为7.4溶液中进行.以杂交反应后的电极作为工作电极,控制恒电位为1120V,以电化学发光信号S（S为施加电压后10s内的电化学发光积分值为分析信号,进行目标ssDNA的序列识别及含量测定.

2结果与讨论

2.1纳米金修饰金电极与金电极上目标

DNA检测信号的比较

固定目标DNA浓度为5.0@10-9mol/L,电化学发光探针Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au浓度为1.0@10-7

mol/L,按实验方法分别在裸金电极和纳米金修饰金电极上进行杂交反应和电化学发光测量,试验结果图1所示.从图1可以看出,比较目标DNA（MT分别固定在金电极和纳米金修饰电极上杂交之后的检测信号,ECL峰值分别为1130、2074,发光信号增强约一倍.如果对施加电压后10s内的发光值进行积分,在金电极和纳米金修饰电极上的电化学发光积分值分别为3818和8831,提高2.3倍.该实验结果说明,在纳米金修饰电极上比金电极的灵敏度高.为了解释纳米金修饰电极比金电极的灵敏度高的原因,我们进行了两种电极的电极面积.

70陕西师范大学学报（自然科学版第34卷

图1金电极与纳米金修饰电极上电化学发光的比较Fig.1ECLprofilesatthebaregoldelectrodeandAunano-particle/1.6-Hexanedithiol/goldelectrode

a.金电极;b.纳米金修饰电极

从裸金电极和纳米金修饰金电极在0.1mol/LH2SO4溶液中的循环伏安实验中可以看出,在扫描范围0~1.5V（以Hg/Hg2Cl2（3.0mol/LKCl为参比电极内,纳米金表面的金原子与金电极表面的金原子一样,随着电极电位的变化而被氧化或还原,测出+0.8V左右金的阴极峰的峰面积（电量,根据金表面电吸附氧形成单分子层AuO所需的双电层电荷系数（0.386mC/cm2[9],可以算出电极的真实面积[10]

.平行测定7次,根据还原峰面积计算得到金电极的真实面积的平均值为0.024cm2,纳米金修饰金电极的真实面积为0.036cm2

面积提高1.5倍.该值与电化学发光信号的提高基本一致.

目标DNA（MT在电极表面的固定量可以用电化学的方法测量.按文献[11]方法,在含有Co

（bpy2+3低离子强度的溶液中,Co（bpy2+

3能取代DNA骨架上的其他正离子,强烈地富集在ssDNA修饰电极上.单链DNA在修饰电极上的固定量0可通过在电极上吸附的Co（bpy2+

3的量来计算.实验结果如图2所示,曲线a和b是在金电极上固定目标DNA,分别在10mmol/LTris（pH值为7.4溶液中和10mmol/LTris（pH值为7.4+50Lmol/LCo（bpy3Cl2混合溶液中的计时库仑曲线;曲线ac和bc是在纳米金修饰电极上固定目标DNA（MT,分别在10mmol/LTris（pH值为7.4溶液中和10mmol/LTris（pH值为7.4+50Lmol/LCo（bpy3Cl2混合溶液中的计时库仑曲线.通过公式Q=2nFAD1/2

0C*

0t1/2

/1/2

+Qdl+nFA0和DNA=z0NA/M,可计算出DNA的固定量DNA,在金电

极上,DNA=1.29@1013分子/cm2,在纳米金修饰电

13分子/cm2.图2DNA/金电极和DNA/纳米金/金电极

在Co（bpy2+3

溶液中的计时库仑图Fig.2ChronocoulometricresponsecurvesatthegoldelectrodeimmobilizedDNA（MTandthegoldnanoparticlemodifiedelectrodeimmobilizedDNA（MT

intheabsenceandpresenceofCo（bpy2+3a、b.DNA/金电极;ac、bc.DNA/纳米金/金电极

出,DNA的固定量提高2.6倍.该值与电化学发光信号积分值的提高基本一致.从以上两个实验可以

看出,纳米金修饰电极上电化学发光灵敏度的提高是由于纳米金具有较大的表面积,可增加目标DNA的固定量所致.

2.2以纳米金为探针载体的放大ECL检测信号

固定有目标DNA的纳米金电极与Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA和Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au两种探针杂交后的电化学发光曲线见图3.

图3两种探针杂交后的电化学发光图Fig.3ECLprofilesofdifferentprobes

hybridizedwithtargetss-DNAa.Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNAb;b.Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au

由图3可以看出,以Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA为探针,电化学发光峰值为786,而以Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au为探针,发光峰值达到2076,

第4期王辉等:

纳米金修饰电极和探针载体的DNA电化学发光分析方法研究71

峰值增加2.6倍.如果对施加电压后10s内的发光值进行积分,在金电极和纳米金修饰电极上的电化学发光积分值分别为2273和8831,纳米金修饰电极使电化学发光积分值提高3.9倍.说明以纳米金为探针载体,可明显提高检测的灵敏度,具有信号放大的作用.

2.3纳米金修饰电极的QCM表征

纳米金自组装过程中QCM频率变化的曲线见图4.开始QCM并没有响应（曲线a,将石英晶体裸基片放在SH（CH26SH溶液中,由于硫原子与金基体有很强的相互作用,巯基化合物SH（CH26SH可在金基体表面自组装形成致密有序膜,QCM

有明

图4纳米金自组装过程中QCM频率变化曲线图Fig.4QCMfrequencychangeasafunctionof

timeinprocessofAunanoponeicles

assimblyontheelectrode

a.goldsurface;b.SH-（CH26-SH/goldsurface;c.goldnanoparticle/SH（CH26SH/goldsurface

显的频率变化,频率变化值约为31?

1Hz;然后在SH（CH26SH修饰的金电极上滴加纳米金,因为硫原子与纳米金有更强的相互作用,可以自组装形成致密有序的单层,QCM频率变化很快,频率变化值也增加,为76?

1Hz.

2.4ECL检测DNA的线性范围和检出限

配制一系列目标DNA标准溶液,以纳米金自组装电极为工作电极,Ru（bpy2（dcbpyNHS-DNA-Au为探针,按实验方法进行实验,测定其电化学发光强度积分值随DNA浓度的变化曲线.结果表明,以纳米金为探针载体,ECL积分强度与目标DNA（MT浓度的对数在1.0@10-12

mol/L~1.0@10-

9

mol/L范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为S=1778lgcSH-DNA+24468,相关系数为0.9954,检出限为5.0@10

-13

mol/L.与文献[6]相

比.0-10

L

浓度的目标DNA进行11次测定,相对标准偏差为4.5%.参考文献:

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1责任编辑王勇2

72陕西师范大学学报（自然科学版第34卷