人鼻咽癌CD133干细胞的生物学特性及意义图文精.docx
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人鼻咽癌CD133干细胞的生物学特性及意义图文精
中国组织工程研究第16卷第6期2012–02–05出版
ChineseJournalofTissueEngineeringResearchFebruary5,2012Vol.16,No.6ISSN1673-8225CN21-1581/RCODEN:
ZLKHAH
1007DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,AffiliatedZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou
510282,GuangdongProvince,China
WangHai-li★,Studyingformaster’sdegree,DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,AffiliatedZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou
510282,GuangdongProvince,Chinawanghaili.12345@Correspondenceto:
WenZhong,Doctor,Professor,DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,AffiliatedZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou
510282,GuangdongProvince,Chinawenzhong60
@Supportedby:
theNaturalScienceFoundationofGuangdongProvince,No.S2011010003947*;ScienceandTechnologyProgramProjectofGuangdongProvince,No.2008B030301344*Received:
2011-11-10Accepted:
2011-12-22
人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义**★
王海丽,文忠,申聪香,钟品能,王军旗
BiologicalcharacteristicsandsignificanceofCD133+cancerstemcellsinhumannasopharyngealcarcinoma
WangHai-li,WenZhong,ShengCong-xiang,ZhongPin-neng,WangJun-qi
Abstract
BACKGROUND:
Recentstudiesshowsthatcancerstemcellsexistincancercelllines,andmayberesponsibleforrecurrenceandmetastasisoftumor.TherearefewreportsonthebiologicalcharacteristicsofCD133+cancerstemcellsinhumannasopharyngealcarcinoma.
OBJECTIVE:
ToexplorethebiologicalcharacteristicsandsignificanceofCD133+cancerstemcellsinhumannasopharyngealcarcinoma.
METHODS:
ExpressionoftheCD133+cellsweredetectedbyflowcytometry,andpurifiedbymagneticcellsortingfromhumannasopharyngealcarcinomacelllineCNE-2.InvitroproliferationandinvivotumorigeniccapacityoftheCD133+stemcellsweredetectedbyserum-freeculture,CCK-8,platecolonyformationtestandtumorigenicityexperimentinnudemice,andwhichstatisticallycomparedwithCD133-andcontrolCNE-2cellstounderstandthebiologicalcharacteristicsoftheCD133+stemcells.
RESULTSANDCONCLUSION:
CD133+cellsmaintainedasphere-likegrowthstatusinserum-freemediuminvitro,andcouldformtumorspheres.ComparedwiththeCD133-cells,theCD133+cellshadhighercolony-formationability（P<0.01.InvivotumorigenesisabilityoftheCD133+cellsinthenudemicewashigherthanthatoftheCD133-cells（P=0.05.TheresultsconfirmedthatCD133+cellscansuccessfullyseparateandcultureinvitro,andcangeneratetumorspheresandhavehightumorigenesisabilityinthenudemice.
WangHL,WenZ,ShengCX,ZhongPN,WangJQ.BiologicalcharacteristicsandsignificanceofCD133+cancerstemcellsinhumannasopharyngealcarcinoma.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2012;16（6:
1007-1010.
[]
摘要
背景:
有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道。
目的:
观察人鼻咽癌CD133+干细胞生物学特性及意义。
方法:
采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况。
免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133+干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133+干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133+干细胞的生物学特性。
结果与结论:
免疫磁珠富集的CD133+细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球。
CD133+细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力（P<0.01;CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞（P<0.05。
结果证实,鼻咽癌CD133+干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力。
关键词:
鼻咽癌;肿瘤干细胞;增殖;生物学特性;干细胞培养
doi:
10.3969/j.issn.1673-8225.2012.06.013
王海丽,文忠,申聪香,钟品能,王军旗.人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义[J].中国组织工程研究,2012,16（6:
1007-1010.[http:
//www.crter.org]
0引言
肿瘤干细胞理论认为,肿瘤中存在肿瘤干细胞,他们具有自我更新和无限增殖潜能[1]。
到目前,已经在白血病、神经胶质瘤和结肠癌等细胞中发现了肿瘤干细胞[2-4]。
王静等[5]采用流式细胞术从鼻咽癌细胞株中分选出侧群细胞,具有较强的增殖活性。
实验采用了免疫磁珠分选术分选出CD133+肿瘤干细胞。
进一步研究肿瘤干细胞的生物学特性。
1材料和方法
设计:
细胞学体外实验。
时间及地点:
于2010-08/2011-05在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。
材料:
实验动物:
BALB/c-nu裸鼠8只,4~6周龄,体质量16~23g,购自南方医科大学实验动物中心。
动物许可证号:
SKXY（粤2006-0074。
实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性
王海丽,等.人鼻咽癌CD133+
干细胞的生物学特性及意义
P.O.Box1200,Shenyang110004
1008
www.CRTER
.org
南方医科大学附属珠江医院耳鼻咽喉头颈外科,广东省广州市510282
王海丽★,女,1985年生,汉族,河北省邯郸市人,南方医科大学在读硕士,主要从事鼻咽癌基础与临床研究。
wanghaili.12345@
通讯作者:
文忠,博士,教授,南方医科大学附属珠江医院耳鼻咽喉头颈外科,广东省广州市510282wenzhong60@
中图分类号:
R394.2文献标识码:
B
文章编号:
1673-8225（201206-01007-04
收稿日期:
2011-11-10
修回日期:
2011-12-22（20111110002/WJ·G
意见》[6]。
细胞株:
人鼻咽癌细胞株CNE-2由南方医科
大学病理科提供。
试剂及仪器:
方法:
流式细胞技术检测及免疫磁珠技术分选CNE-2中鼻咽癌CD133+
干细胞:
取对数生长的CNE-2细
胞,消化离心后PBS重悬,进行CD133/2（293C3-PE标记（按照说明书操作,流式细胞仪检测细胞CD133比例[7]。
取CNE-2单细胞悬液,加入FcR阻断剂100μL,加入磁珠100μL,4℃,孵育30min。
用500μLBuffer湿柱。
加入细胞悬液,过磁珠分选柱收集未标记细胞。
用Buffer洗柱,收集流出液,与上述液体混合。
将MS柱从磁珠分离器上移开,往柱中加入1mLBuffer,用针芯快速将缓冲液推出,收集液体中含有CD133+细胞。
所得的CD133+细胞离心5min,1000r/min,去上清,收集CD133+和CD133-细胞,加入无血清培养基37℃、体积分数5%CO2饱和温度的培养箱中培养[8]。
CCK-8法检测CD133+
干细胞体外增殖能力:
将
分选的CD133+细胞,CD133-细胞以及未分选的细胞种植于96孔板内,每孔加入0.2mL无血清培养液,无血清培养液含DMEM/F12（11∶、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF、20μg/L表皮生长因子（EGF、5mg/L胰岛素的无血清培养液,2000细胞/孔（设空白组用于调零。
置于37℃、体积分数5%CO2饱和温度的培养箱中培养,每隔3d半量换液1次,在培养第1,3,5,7天测定细胞的增殖状态,以490nm吸光度（A值量化活细胞数,每组所得数据取均值,以时间为横轴,A值为纵轴,绘制细胞生长曲线、比较3组细胞的增殖速度[9]。
体外成球试验检测CD133+
干细胞体外成球能力:
配制无血清培养基,取分选后的CD133+
细
胞和CD133-细胞在上述无血清培养液中,置于37℃、体积分数5%CO2饱和温度的培养箱中培养,每天加入0.25mL上述无血清培养液,观察
肿瘤细胞克隆球形成过程,倒置显微镜观察并摄片
[10]
。
体外平板克隆形成实验检测CD133+
干细胞克隆形成能力:
将分选的CD133+
细胞,CD133-
细
胞进行细胞计数,以每200个细胞接种于含10mL上述无血清培养液的6孔板中,每种细胞3个复孔,置于37℃、体积分数5%CO2饱和温度的培养箱中培养两三周。
当6孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养,弃去培养液,用PBS小心浸洗2次,加纯甲醇固定15min。
弃甲醇后空气干燥,加适量结晶紫室温固定15min。
洗去染料后再显微镜下计数大于50个细胞的克隆数,然后计算克隆形成率。
实验重复3次。
裸鼠体内成瘤试验检测CD133+
干细胞体内成瘤能力:
将8只裸鼠分为CD133+
组和CD133-
组,
每只裸鼠注入细胞量为1×105。
固定裸鼠,碘伏消毒左、右侧背部皮肤,分别向皮下注射CD133+和CD133-细胞（悬浮于0.2mL生理盐水[12]。
用碘伏消毒皮肤。
移植后饲养于高度洁净无特殊病原体（speeificpathogenfree,SPF无菌净化室内。
每周观察1次,肉眼观察和触诊,观察4周后采用断颈法处死。
测量肿瘤大小,照相。
处死后立即取出肿瘤,用体积分数10%甲醛溶液固定,脱水,石蜡包埋,切片,过夜,苏木精伊红染色确定病理类型[12]。
在普通光学显微镜下观察裸鼠移植瘤组织形态。
主要观察指标:
流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况;无血清培养法检测人鼻咽癌CD133+干细胞成球情况;CCK-8法检测CD133+干细胞体外增殖情况;平板克隆形成试验检测CD133+干细胞克隆形成能力及裸鼠体内成瘤实验检测CD133+干细胞的体内成瘤能力。
统计学分析:
计量资料以x_
±s表示,采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析,多组间比较采用单因素重复测量数据的方差分析,组间均数差异的两两比较采用LSD-t法,两样本数据采用两独立样本t检验,四格表资料采用卡方检验,P<0.05为差异有显著性意义。
2结果2.1实验动物数量分析纳入大鼠8只,均进入结果分析,无死亡或感染,无脱落。
2.2鼻咽癌CD133+干细胞分离鉴定结果采
试剂及仪器
来源
DMEM/F12培养基,重组人碱性成纤维生长因（bFGF
表皮生长因子（EGF
胰岛素
（Insulin,人CD133细胞分选试剂盒,MACS磁珠分选柱CD133/2（293C3-PE,Cell
CountingKit-8（CCK-8试剂盒
美国PeproTech公司
美国sigma公司德国MiltenyiBiotec公司中国碧云天公司
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用流式细胞术检测了CNE-2鼻咽癌细胞株中CD133的表达情况,流式分析结果显示细胞株中恒定在0.2%~2.59%。
见图1。
2.3鼻咽癌CD133+干细胞生物学特性
CD133+
肿瘤干细胞球形成:
在无血清条件下细胞悬浮
生长,培养10d后形成肿瘤细胞球体,球体折光性好,大小不一,从十几个细胞到几十个细胞不等,见图2。
CD133+
干细胞体外增殖能力:
结果表明CD133+
组的
细胞增长幅度最大,与CD133-
组比较,各组细胞培养72h后,CD133+细胞增长速度大于CD133-与未分选细胞（P<0.05。
见表1。
细胞的体外克隆形成能力:
通过计算得出平均克隆形
成率分别为CD133-（7.33±8.50%和CD133+
细胞（34.66±
8.50%。
CD133+细胞的克隆形成能力明显高于CD133-细胞（P<0.01,见图3。
CD133+干细胞裸鼠体内成瘤能力:
1×105个CD133+
细
胞在接种4周之后,可在7只裸鼠体内形成移植瘤;而1×105个CD133-细胞在裸鼠体内均未成瘤,CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞（χ2=12.44,P<0.05,见图4。
3讨论
自2003年Sighs等[1]报道了神经胶质瘤CD133标记
a:
CD133-
cells
Figure3ThefirstgenerationofCD133+cellsaftersortingandinvitrocloneformationabilityofCD133-cellsat3wk
afterculture
图3分选后第一代CD133+细胞和CD133-细胞培养3周后体外克隆形成能力
b:
CD133+
cells
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的肿瘤干细胞的分选,已有多位学者对卵巢癌、胃癌与前列腺癌等肿瘤
[12-14]
课题组前期研究工作也从鼻咽癌
中发现了肿瘤干细胞[7]
。
随着对肿瘤干细胞的进一步研究发现,肿瘤干细胞与肿瘤的复发、转移、多药耐药有关。
因此,研究肿瘤干细胞的生物学特性为临床上提高肿瘤治愈率、降低复发率提供了新思路。
CD133被认为是多种肿瘤干细胞的表面标记物[1,15-16],一小部分肿瘤细胞表达CD133+。
本文针对鼻咽癌CNE-2细胞首先采用了流式细胞技术检测CD133+细胞含量,证明在鼻咽癌细胞株CNE-2中确实有0.2%~2.59%的细胞表达CD133抗原,与文献[17]报道一致。
实验结果发现,通过免疫磁珠分选方法可高效分选出CD133+细胞,同时还发现细胞的活力、细胞量、细胞混悬液制备及分选时间的长短均可以影响分选效果。
CD133+
细胞具有自身独特的生物学特性,有极强的
自我更新及增殖能力。
在无血清成球实验中,可形成悬浮生长的肿瘤干细胞球。
实验在无血清的配制方面,与文献[18]报道有所不同,实验未加入B27因子,可能原因为细胞株不同对细胞因子的需要不同。
3组亚群细胞的生长曲线结果、平板克隆形成实验结果表明,CD133+细胞的增殖能力和克隆形成能力高于CD133-细胞,此结果与以往文献报道一致[5,7],因此也证明了鼻咽癌细胞群中确实存在一小部分细胞,特性不同于其他细胞。
在肿瘤干细胞的鉴定实验中,裸鼠体内成瘤被认为是一种更加可靠的方法。
在以往的肿瘤干细胞鉴定试验中,进行了大量体外细胞学实验的验证。
而本文的创新点在于,采用了免疫磁珠分选出CD133+细胞后,不仅进行了体外实验,还通过裸鼠体内成瘤实验来鉴定,显示CD133+
细胞的成瘤性高于CD133-
细胞,证明CD133+
细胞中含有肿瘤干细胞,与体外实验结果一致,这种方
法系统全面且可信度高。
CD133是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段,实验中采用了CD133标记的表面标记物富集肿瘤干细胞。
也有研究通过细胞表面抗原CD44[19],ABCG2[20],Oct4等筛选肿瘤干细胞[16],迄今为止仍未发现特异性的肿瘤表面标记物。
目前,对肿瘤干细胞的研究仍在探索阶段,目前鉴定肿瘤干细胞的基本方法都只是富集了肿瘤干细胞,并未真正意义上将肿瘤干细胞分离出来,寻找肿瘤干细胞特异性标记物是进一步研究的方向。
致谢:
感谢郝卫、温坤、郭勇辉老师和肖法嫚博士在实验技术方面给予的帮助,感谢南方医科大学珠江医院中心实验室提供的仪器和设备。
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[6]TheMinistryofScienceandTechnologyofthePeople
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