浅论SDF.docx

浅论SDF.docx

《浅论SDF.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅论SDF.docx（5页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

浅论SDF

浅论SDF

【摘要】目的研究骨髓基质细胞的CXCR4表达，SDF-1对BMSCs迁移、趋化作用，分析促进迁移规律和机理。

为改善和提高骨髓基质细胞迁移能力寻找更有效的途径。

为临床骨髓基质细胞更广泛的应用奠定基础。

方法体外培养大鼠骨髓基质细胞，应用免疫组化方法对骨髓基质细胞的CXCR4受体表达水平进行检测，运用微孔隔离室穿越实验方法，研究SDF-1对骨髓基质细胞迁移、趋化作用，并用SDF-1阻断剂加以证实。

结果CXCR4在各代骨髓基质细胞中表达小于5%，SDF-1可促进骨髓基质细胞迁移。

结论虽然CXCR4在骨髓基质细胞中表达量很少，但是对促进骨髓基质细胞迁移起到至关重要的作用。

【关键词】骨髓基质细胞;基质细胞衍生因子-1;迁移

Abstract:

ObjectiveToinvestigateCXCR4expresstionofbonemesenchymalstromacells,andtheeffectsofSDF-1/CXCR4inpromotingmigrationofbonemesenchymalstromacellsandtoanalyzethemechanismofmigrationofbonemesenchymalstromacells,whichaimstofindmoreeffectivewaysofimprovingmigrationability.MethodsBonemesenchymalstromacellsofratswereculturedinvitro.ReceptorofCXCR4wasdetectedbyimmunohistochemistry.Migrationofmarrowstromacellswereinvestigatedbyempiricalmethodoftranswell.ResultsThereceptorofCXCR4onbonemesenchymalstromacellswaslessthan5%,andSDF-1couldpromotemigrationofbonemesenchymalstromacells.ConclusionsAlthoughthereisalittlethereceptorofCXCR4onbonemesenchymalstromacells,whichplaysanimportantroleinpromotingmigrationofbonemesenchymalstromacells.

　　Keywords:

bonemesenchymalstromacells（MSCs）;stromalcel1derivedfactor-l（SDF-1）;migration

　　基质细胞衍生因子-1（stromalcel1derivedfactor-l，SDF-1）及其趋化因子受体（CXCR4）作为一个趋化因子家族的新成员，在调节造血过程中发挥重要的作用。

它在骨髓微环境中的高表达与造血干/祖细胞释放至外周血循环有关，并可作为一个评价造血动员过程中CD34+细胞峰值出现的指标。

近来研究表明，SDF-1对多种干细胞和成体细胞有趋化作用，而且是多种干细胞、肿瘤细胞和淋巴细胞的生长因子。

因此，随着对SDF-1/CXCR4研究的不断发展，人们愈来愈关注其在多种生物学效应中的重要作用。

　　SDF-1对细胞的趋化作用是通过其受体CXCR4来调节、是己知的CXCR4的唯一配体。

研究表明，SDF-1可诱导大多数循环淋巴细胞和CD34+前体细胞的黏附，使细胞定向性迁移致特殊部位，但SDF-1对CD34-细胞是否有趋化作用尚有争论。

本实验目的是运用微孔隔离室穿越实验方法，研究SDF-1对BMSCs迁移、趋化作用，并用SDF-1阻断剂加以证实。

　　1材料与方法

　　材料

　　SDF-1（R&D，英国），CXCR4阻断型Ab（R&D公司）。

DMEM培养液（Gibco，BOSTER），胎牛血清（BOSTER），3月龄雄性SD大鼠，兔抗鼠多克隆抗体CD34，CD44，CD45，CD54、CXCR4（BOSTER），免疫组化（SP）试剂盒（BOSTER公司）。

倒置像差显微镜（OLympasCK40），CO2培养箱（Toua3法国），自动酶标检测仪（BioRad550，美国），Transwell-clear48孔板（Costar，美国），孔径8μm。

CO2培养箱（Heraeus），超净工作台（Nuair），低速离心机（Heraeus），胰蛋白酶（Sigma）。

　　方法

　　骨髓基质细胞分离和培养

　　大鼠颈椎脱臼处死后，取其双侧股骨和胫骨。

在超净台内剪断上下干骺端，用含10%胎牛血清的DMEM注射器插入骨髓腔冲洗，将骨髓细胞冲入培养皿中，用DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，然后加入适量的DMEM（含10%胎牛血清），置37℃，5%CO2培养箱培养。

每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。

2天后换液，以去除未贴壁的血细胞，以后每隔3天换液1次。

培养细胞铺满后用%胰蛋白酶1∶2消化传代。

免疫组织化学方法对MSCs进行鉴定

　　免疫组织化学方法检测MSCs中CXCR4表达

　　Poly-Lysine玻片防脱片剂处理，取2-10代MSCs细胞制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定20min，30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5～10分钟。

蒸馏水洗3次。

滴加5%BSA封闭液，室温20分钟。

甩去多余液体。

滴加稀释的一抗（CD34∶1∶200、CD44∶1∶200、CD54∶1∶200、CXCR4∶1∶100），37℃1小时。

PBS洗2分钟×3次。

滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃20分钟。

PBS洗2分钟×3次。

滴加试剂SABC，37℃20分钟。

PBS洗5分钟×4次。

使用DAB显色试剂盒（AR1022）显色。

蒸馏水洗涤。

脱水，透明，封片。

同样方法对神经胶质细胞中CXCR4检测进行对照。

显微镜观察，MSCs细胞表面CXCR4的检测：

以细胞胞浆中显示棕黄色颗粒定为阳性反应。

每张涂片计数100个细胞;依细胞的反应强度计分（0～4分），计算细胞的平均反应强度的积分值（%）。

　　微孔隔离室穿越实验

　　每六孔为一组，transwell经无血清的DMEM培液于培养箱中平衡1小时;消化细胞（2代），无血清培养基洗2次，计数，配成（1×106/mL）细胞悬液，上室每孔加入100μL细胞悬液;Transwell板下室分别置、含不同浓度的重组人SDF-1（0、50、100、150、200、250、300ng/mL）的无血清的DMEM，另取一组上、下室同时加入100ng/mLSDF-1，置于5%CO2，37℃饱和湿度培养箱培养24h;用棉球擦去上表面细胞，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，显微镜下观察计数。

　　阻断试验

　　将CXCR4阻断型抗体20g/mL和20%FBS的DMEM空白对照分别与1×106/mLBMSCs作用20min后，加入上室;BMSCs培养上清液、含100ng/mLSDF-l的DMEM及DMEM空白对照置于transwell板下室，37℃饱和湿度培养箱温育24h，用棉球擦去上表面细胞，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，显微镜下观察计数。

　　统计方法

　　计数穿过微孔及黏附于膜下表面的细胞，随机取5个视野（光镜200×）的细胞数。

数据使用均值±标准差表示。

应用EXCELL2003统计软件对实验数据进行方差分析及q检验。

　　2结果

　　CXCR4抗原表达

　　原代培养骨髓基质细胞约24～48h贴壁，细胞初为淋巴细胞样小圆细胞。

约7～l0d可铺满培养皿，细胞融合成单层。

此时细胞为多角形、三角形或梭形，呈集落状生长。

传代培养原代细胞逐渐伸展为梭形、三角形、多角形，胞体较原代略膨大，有胞浆突起，成旋涡或平行状排列。

5～7d即可长满。

MSCs鉴定：

MSCs免疫组化显示CD34、CD45表达阴性，CD44、CD54表达阳性，第5代MSCs特异性表面标志物CD44，CD54表达率分别是%，%（图1）。

　　免疫组化显示MSCs有CXCR4抗原表达，但表达量很少，2代阳性率%（图2），以后逐渐减少、减弱，3代%，4代%，5代以后几乎无阳性表达。

　　SDF-1诱导细胞迁移的结果

　　当下室无SDF-1，BMSCs细胞迁移细胞数为8±，当下室加入SDF-1趋化因子，BMSCs细胞迁移细胞数明显增加，表明SDF-1能够显着增加诱导迁移细胞，SDF-1浓度分别为50、100、150、200、250、300ng/mL时迁移细胞数为（±），（±），（±），（±），（±），（±）;加入SDF-1组与未加SDF-1组相比有显着差异（）。

在0～150ng/mL浓度内SDF-1诱导BMSCs呈浓度依赖关系，达到最佳迁移效果的SDF-1浓度为150ng/mL，再增大SDF-1浓度后，迁移的BMSCs增加数目不明显，无统计学差异（）见表1。

上、下室同时加入SDF-1，迁移细胞数与无SDF-1组无明显差别（）。

表1SDF-1浓度对细胞迁移细胞数影响SDF-1浓度

　　CXCR4阻断型抗体对BMSCs细胞迁移的影响结果

　　CXCR4阻断型抗体对BMSCs细胞迁移的影响结果，经过CXCR4抗体孵育后，迁移细胞数与未加SDF-1组无明显差别（）见表2，迁移效应被抵消，进一步表明SDF-1对BMSCs的迁移影响。

表2加入CXCR4阻断型抗体后BMSCs细胞迁移数量SDF-1浓度

　　3讨论

　　趋化因子受体CXCR4在骨髓基质细胞表达特点

　　趋化因子受体CXCR4是G蛋白偶联的7次跨膜蛋白受体。

通过和其配体基质细胞衍生因子-1（Stromalcellderivedfactor1，SDF-1）的相互作用在炎性细胞的浸润和淋巴细胞移行、归巢中发挥着重要作用。

虽然CD34+细胞跨过内皮屏障的迁移受

[1]UnzekS，ZhangM，MalN.SDF-1recruitscardiacstemcell-likecellsthatdepolarizeinvivo[J].CellTransplant,2007,16（9）:

879-886.

　　ZhouB，HanZC，Poon　stem/stromalcells（MSC）transfectedwithstromalderivedfactor1（SDF-1）fortherapeuticneovascularization:

enhancementofcellrecruitmentandentrapment[J].MedHypotheses,2007,68（6）:

1268-1271.

　　WynnRF，HartCA，Corradi-Perini　smallproportionofmesenchymalstemcellsstronglyexpressesfunctionallyactiveCXCR4receptorcapableofpromotingmigrationtobone[J].2004,104（9）:

2643-2645.

　　YaoL，SalvucciO，CardonesAR.Selectiveexpressionofstromal-derivedfactor-1inthecapillaryvascularendotheliumplaysaroleinKaposisarcomapathogenesis[J].Blood,2003,102（12）:

3900-3905.

　　StichS，Haag　expressionprofilingofhumanmesenchymalstemcellschemotacticallyinducedwithCXCL12[J].CellTissueRes,2009,336

（2）:

225-236.

　　LiN，LuX，Zhao　nitricoxidesynthasepromotesbonemarrowstromalcellmigrationtotheischemicmyocardiumviaupregulationofstromalcell-derivedfactor-1alpha[J].StemCells,2009,27（4）:

961-970.图1BMSCs特异性表面标志物CD44（免疫组化，100×）图2第2代MSCsCXCR4表达（免疫组化，100×）