人溶菌酶的双水相萃取法分离精.docx
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人溶菌酶的双水相萃取法分离精
Vol.32No.12
2006212
华东理工大学学报（自然科学版
JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology（NaturalScienceEdition
收稿日期:
2005212205
作者简介:
冯 菁（19762,女,江西人,硕士生,从事生物工程方面的
研究。
通讯联系人:
徐殿胜,E2mail:
xuds@ecust.edu.cn
文章编号:
100623080（20061221409204
人溶菌酶的双水相萃取法分离
冯 菁, 夏 杰, 陆 兵, 徐殿胜
（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237
摘要:
采用双水相体系直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶,研究了体系中聚乙二醇（PEG平均分子量,PEG、硫酸钠和氯化钠浓度,pH对人溶菌酶和总蛋白的分配系数、相体积比、萃取率和纯化因子的影响。
结果表明:
在PEG4000、Na2SO4和NaCl质量分数分别为0.08、0.13、0.06,pH为5.6时,在室温下的双水相萃取率达96.63%,纯化因子为6.5。
关键词:
人溶菌酶;双水相体系;萃取
中图分类号:
Q559;TQ464.8
文献标识码:
A
SeparationofHumanLysozymefromFermenof
PichiapastorisbyAqueous-FENGJing, XIAJie,2sheng
（StateKeyLaboratoryofBioreactor,UniversityofScienceandTechnology,
ChinaAbstract:
simreusingaqueoustwo2phasesystemwasestablishedfortheseparationofhumanZfromthefermentationbrothofPichiapastoris.Effectsoftherelativemolecularmass,concentrationofpolyethyleneglycol（PEG,Na2SO4andNaCl,andpHvalueonthepartitioncoeffi2cientofHLZ,thevolumeratiooftotalproteinandphase,theyieldandthepurificationfactorwerestud2ied.HumanlysozymeisrecoveredwithahighyieldinthetopphasewhenPEG4000,Na2SO4andNaClwereinthetwo2phasesystemwiththemassfractionof0.08,0.13,0.06respectivelyatpH5.6.Thepuri2tyofHLZincreasesbythefractorof6.5withayieldof96.63%.
Keywords:
humanlysozyme;aqueoustwo2phasesystem;extraction
人溶菌酶（HLZ是一种由130个氨基酸组成,相对分子质量为1.469×104的碱性蛋白,可水解N2乙酰胞壁酸和N2乙酰氨基葡萄糖之间的Β21,4糖苷键而破坏细菌细胞壁结构,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用[1]
。
随着研究的深入,人溶菌酶的临床应用及大规模生产日益受到重视
[2~3]
。
目
前少量的商品化人溶菌酶主要是从人乳中提取纯化,但由于来源极其稀少,且可能含有未知病原而远
不能满足市场需要[4]。
由重组巴氏毕赤酵母发酵制备人溶菌酶解决了需求大而来源少的矛盾[5],但是目前主要的提取步骤中[6],超滤浓缩发酵上清液造成酶在膜上的吸附和活性损失,后续的强阳离子柱层析处理量小,成本高,成为人溶菌酶大规模生产的瓶颈。
双水相萃取是分离和纯化酶及蛋白质等生物活性物质的一种新方法,具有条件温和、产品活性损失小、处理量大、分离步骤少、无有机溶剂残留、设备投资小、操作简单、易于工程放大和连续操作等优点,非常适合大规模应用[7]。
本文采用双水相体系萃取发酵上清液中的人溶菌酶,利用它在两相中的不同
9
041
分配,达到其与发酵液中其他杂质分离的目的。
实验研究了聚乙二醇（PEG平均分子量、PEG浓度、硫酸钠浓度、氯化钠浓度及体系pH对溶菌酶和总蛋白分配系数、相体积比、纯化因子和萃取率的影响,优化了双水相系统组成,使之可以直接接后续精制工艺。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与发酵液 重组巴氏毕赤酵母SMD1168由长春奇龙生物技术研究所提供,发酵液
由本实验室发酵获得。
1.1.2 试剂 硫酸钠、硫酸铵、磷酸钾、氯化钠均为
分析纯;聚乙二醇（平均分子量分别为600、4000、
6000,化学纯;BCA蛋白定量试剂盒,碧云天公司;溶菌酶检测试剂盒,南京建成生化研究所。
1.2 仪器与设备
WFZUV22000型紫外可见分光光度计,上海
合利仪器有限公司;GL221M低温高速离心机,离心机研究所;DG5031;,Amersham公司。
1.3 实验方法
1.3.19000rmin离
心30min,收集上清液,于4°C冰箱中保存。
1.3.2 双水相萃取 将平均分子量为600、4000、6000的聚乙二醇和各成相盐分别配制成所需pH
的储液备用。
根据试差实验设计,按质量比配制好一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相体系,每个双水相体系改变一个参数。
由于备用溶液粘度很高,为减小误差,备用溶液的加入量用质量测定,各组分含量均以质量分数（w表示。
加入料液后,再用去离子水调系统总质量至50g。
将离心管封口,反复倒置10~15min,每分钟10~15次,将体系各组分充分
混合均匀后,室温下于4000rmin离心5min,使体系上下相分离完全。
测定上下相体积,分别取样测定上下相中的总蛋白浓度和溶菌酶活力,计算相比（R、总蛋白分配系数（KP、溶菌酶分配系数（KHLZ、纯化因子（PF和萃取率（Y。
计算式为:
K=
cb, R=Vb
PF=
c0, Y=1+R×K
式中:
ct为上相浓度,cb为下相浓度,c0为萃取前浓
度,Vt为上相体积,Vb为下相体积。
1.3.3 蛋白浓度测定 参照BCA蛋白定量试剂盒
方法测定。
1.3.4 舒加法溶菌酶活力测定[8] 用溶菌酶检测
试剂盒按操作说明和文献[8]的方法测定。
1.3.5 SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳 按常规作垂直板凝胶电泳,扫描测定条带面积以计算目标蛋白的相对纯度。
1.3.6 相图绘制 将平均分子量为400、4000、6000的PEG和无机盐分别制成一定浓度的原液。
准确称取一定量PEG原液,加入试管中,然后加入无机盐原液,混合,直至试管开始出现混浊为止。
计量加入的无机盐量,算出PEG和无机盐在系统中的质量分数。
再加入适量水,使体系变澄清,计量加入的水,并继续加入无机盐,,如此反复操作,计算达到混浊时,,如图1-.24exp[-（wNa2SO4+
0.37164.233]
（1
图1 PEG4000Na2SO4双水相体系相图
Fig.1 PhasediagramofPEG4000Na2SO4system
2 结果与讨论
2.1 PEG平均分子量的确定
成相聚合物的平均分子量是影响分配平衡的重
要因素。
一般聚合物平均分子量较低时,蛋白质更易分配于富含该聚合物的相中,这普遍适用于任何成相聚合物和生物大分子溶质组成的系统。
但是,PEG平均分子量的减小,虽然有利于总蛋白分配系数的增加,却往往会导致对目标蛋白的选择性降低。
实验结果表明:
PEG平均分子量由6000降为4000时,HLZ在两相间的分配系数（KHLZ和总蛋白分配系数（KP均显著增加;当PEG平均分子量由4000降为600时,KP变化不大,而HLZ的分配
0141 华东理工大学学报（自然科学版第32卷
系数则显著降低,如表1所示。
在其他萃取条件相同情况下,PEG4000成相体系的萃取率（YHLZ及纯化因子（PF均高于PEG600和PEG6000的体系（表1。
从聚合物的使用量和成本考虑,PEG平均分子量越低,成相所需盐浓度及PEG浓度也越高,成本越高,相反增加PEG平均分子量,因其疏水性增强导致目标蛋白分配系数降低。
因此,本实验确定PEG4000为最优选择。
表1 PEG平均分子量对KHLZ、KP、PF及YHLZ的影响
Table1 EffectofmolecularweightofPEGonpartition
coefficient,yieldandpurificationfactorofHLZ
M
r
KHLZKPPFYHLZ（%
60010.564.184.778.40400098.405.346.097.436000
28.20
1.56
1.7
90.24
2.2 最适PEG浓度的选择
实验中固定双水相体系的其他成相条件,仅改变PEG4000浓度,测定并计算各体系的R、KHLZ、
KP、PF及Y。
结果表明:
在一定的Na2SO4当PEG浓度增加时,KHLZ先增后减,点,同时此点的KP最小而KZ2a图1分析,Na24时,随着PEG,系统远离临界点,。
但当PEG浓度增大到一定程度时,成相物质分子间的作用增大,相界面张力亦增大,系统黏度也会增大,溶质在相间的传递和在相内的扩散阻力大大增加,反而不利于目标蛋白分子进入PEG相。
因此,分离HLZ存在一个最适PEG浓度,根据实验确定为wPEG=0.08,见图2b。
2.3 Na2SO4浓度的确定
对于以PEG4000和硫酸钠为成相物质的双水相体系,固定wPEG=0.08,研究Na2SO4浓度对HLZ和总蛋白与分配系数的影响。
Na2SO4浓度具有选择作用,在最适浓度,对应的KHLZ和KP分别为最大与最小,这实际上取决于系统的热力学性质。
从图3可见,wPEG=0.08时,两相区内Na2SO4浓度在一定范围内的增加,相比减小,有利于HLZ富集于PEG相,但盐浓度过高不仅影响蛋白质的表面疏水性,而且扰乱双水相系统,改变各相中成相物质的组成和相体积比。
因此分离HLZ存在一个最适Na2SO4浓度,根据实验确定为w
PEG
=0.13
。
图2wPEGP、HLZ的影响
2 KHLZ、KP、PFandYHL
Z
图3 wNa2SO4对KHLZ、KP、PF及YHLZ的影响
Fig.3 EffectofwNa2SO4onKHLZ、KP、PFandYHLZ
2.4 NaCl浓度的影响
双水相萃取时,盐对带电蛋白质分子的分配影
响很大。
由于盐的正、负离子在两相间的分配系数不同,形成相间电势差。
溶菌酶等电点约为11,在系统
pH为5.6时HLZ带正电,当加入NaCl调节上、
下相电位使上相电位低于下相电位时,溶菌酶分配系
1
141第12期冯 菁,等:
人溶菌酶的双水相萃取法分离
数将增大。
固定成相物质的种类及浓度不变,分别加入不同量的NaCl后,测定并计算各体系R、KHLZ、
KP、YHLZ和PF。
实验结果表明:
随着NaCl浓度的增
加,KHLZ和YHLZ先增后降。
当wNaCl=0.06时,KHLZ和
YHLZ出现极大点,而KP出现极小点（图4a。
这是因
为离子强度对不同蛋白质的分配平衡有不同的影响程度,而Na+和Cl-在两相分配情况的不同会引起两相电位差的变化,所以添加适量的NaCl有利于
HLZ富集于上相。
根据实验确定系统中wNaCl=0.06（图4b最佳
。
图4 wNaCl对KHLZ、KP、PF及YHLZ的影响
Fig.4 EffectofwNaClonKHLZ、KP、PFandYHLZ
2.5 pH的影响
pH对分配的影响:
一是影响蛋白质分子中可
离解基团的离解度而改变蛋白质分子所带电荷的性
质和数量;二是影响双水相体系中盐的离解度而改变相间电位差。
pH的微小变化甚至可能使蛋白质分子的分配系数改变2~3个数量级。
在固定其他条件,仅改变系统pH时,结果显示随着体系pH的变化,KHLZ先增后减,在pH为5.6时出现极大点,KP则在该处出现极小值（图5a,此时YHLZ达到96.63%,PF为6.5。
因此确定萃取分离HLZ的体系最佳pH为5.6（图5b。
2.6 电泳分析结果
样品电泳结果见图6,双水相萃取分离后杂蛋
白大量去除,电泳纯度达96.46%
。
图 pH对K、KYHLZ的影响
Fig.5pHPPFandYHL
Z
图6 萃取前后样品电泳图
Fig.6 SDS2PAGEanalysisofpurityofHLZ
1—Normativeegg2lysozyme;2—Marker;3—SampleofthetopphaseofATPS;4—Samplefromthefermentationbroth
3 结 论
双水相系统一步可使目的酶分配在上相而与杂质分开,萃取率可达96.63%,纯化因子达6.5,电泳纯度达96.46%,原发酵上清液中酶活力为13382UmL,双水相分离后上相酶活力为86984UmL。
此技术避免了超滤浓缩过程中的目标蛋白损失,简化纯化工艺,降低分离成本,若下游再增加凝胶分子筛或疏水层析,基本可形成有产业化前景的工艺。
（下转第1439页
2141 华东理工大学学报（自然科学版第32卷
计算值:
C 32.89%,H 3.59%,N 19.17%;实测值:
C 32.88%,H 3.57%,N 19.12%。
2 结果与讨论
本文所用的合成方法与文献[2]比较类似,在以下3个方面进行了改进:
（13的甲氧基乙酰化与6的合成:
用甲氧基乙酸酐取代乙酸酐对3中的氨基进行酰化,虽然前者的价格较后者高,但是酰化反应的收率由67%提高到了90%,相对于4的价格,这在经济上是合理的。
更有意义的是:
2,62二（乙酰氨基嘌呤与5的反应需要120h,收率只有40%,而4与5反应则快得多,只需要36h,且收率达到95%。
（28中苄基的脱除:
为了脱去8中的苄基,文献[5]采用在反应液中通入三氯化硼气体的方法。
实验表明,这很不可取,因为三氯化硼气体不稳定,很危险,再则反应温度很低,要求-70°C以下,这将给以后的工业化生产带来很大的困难。
经过反复探索,
地去掉8中的苄基。
同时发现,
接近中性的介质中进行,8的2倍,反应收率,
发生;,则氯化钯的物质的量只是8的0.5倍摩尔量,反应收率可提高到85%,且没有消去氟基团的副反应发生。
（31的离析:
文献[1]中使用阳离子树脂法从水介质中提取1,使用离子树脂的过程相当复杂。
本研究用去离子水直接结晶从水中离析1,该方法相当简便。
实验表明,当去离子水的温度是50°C,物质的量是1的6.3倍时,从水中离析1的收率可达到78%。
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（上接第1412页
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9341
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