整理免疫学实验指导080410.docx
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整理免疫学实验指导080410
免疫学实验指导
生命科学与工程学院生物工程、生物技术、动物医学专业用
冯玉萍
[分组]：
4人/组，实验用动物、器材以每组需要量设计
[班级]2006生物工程、生物技术[学生人数]：
65人/58人。
分16组/15组
[时间]2008年3月—2008年7月两周一次4学时。
实验一、免疫学实验动物的一般操作
实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察
实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法
实验四、淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成试验
实验五、IgG的分离和纯化
实验六、玻片凝集试验（ABO血型鉴定）
实验七、环状沉淀试验
实验八、琼脂扩散试验（单向）
实验九、巨噬细胞吞噬功能试验
实验十、白细胞吞噬试验
实验一、免疫学实验动物的一般操作
[实验原理]
实验动物的基本操作是免疫学实验的基础,抗原对动物机体的免疫效果，通过实验动物进行验证，因此必须掌握实验动物的一般操作技术。
[目的要求]
1、实验材料的准备（棉球、注射器的准备与消毒）（演示）
2、了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。
[自学]
3、学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。
4、练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。
5、练习小白鼠的取血方法。
6、学习血涂片的制作及染色；观察动物血液中有形成分的形态结构特点。
[实验动物]小白鼠，2只/组，共需18~20只。
[试剂]
⑴3%来苏儿或3%石炭酸100~150ml/组；
⑵无菌生理盐水100~150ml/组；磷酸盐缓冲液20~50ml/组（带滴管、染色用）。
⑶3~5%苦味酸20~50ml/组（带滴管,编号用）；
⑷5%品红20ml~50ml/组（带滴管，编号用）；
⑸瑞特氏（wright‘s）染色液50ml/组（带滴管，染色用）；
*抗凝剂一支
[器材]
⑴1ml注射器及针头2支/组；
⑵碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；
⑶手术剪刀2把/组；镊子2把/组；载玻片、盖玻片各6片/组；
⑷毛细吸管2支、50—100ml烧杯1个/组
⑸显微镜6台/组
[6]鼠笼1个/组
[操作步骤]
1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射、皮内注射、腹腔注射的方法。
（见《免疫学实验》P9-13。
2、练习小白鼠尾静脉取血法。
（P15）
实验报告要求：
1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。
2、实验原理、目的要求
3、实验操作记录（实验步骤、结果）
4、分析总结：
依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达到实验目的？
为什么？
5、对实验动物编号有何实际意义，你对书中关于小白鼠的编号方法有何想法？
有无更简便、实用的方法？
6、若给动物注射传染性材料应注意些什么？
实验二、免疫器官与免疫细胞观察
[实验原理]
免疫器官、免疫细胞是动物免疫系统的主体。
在胸腺、脾脏中有大量淋巴细胞存在，在外周血液中有大量淋巴细胞和白细胞等免疫细胞存在，发挥着免疫监视作用。
[目的要求]
1、练习血涂片的制作
2、学习小鼠颈椎脱臼致死的方法，观察小白鼠的解剖结构；
3、学习脾脏、胸腺的触片制备与染色方法；观察小鼠脾脏触片、血液涂片中的免疫细胞，并画图。
[方法与步骤]
1、练习血涂片的制作（3张/组）
1）准备一张洁净玻片，取血1滴于玻片右侧,另取一光边玻片的一端,放在血滴前方,并逐渐后移接触血滴,血液立即沿推片散开,然后将推片与载片保持30一45度角,平稳地向前推动,至玻片另一端,载玻片上便留下一层血膜。
良好的血膜象舌头,头、体、尾鲜明,厚薄适宜、分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。
2）染色：
A、瑞特氏（WrightFs）染色法：
①.血涂片制成后可在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。
选择良好的血片，用特种玻璃铅笔画出两边界限（注意保留尾部，因体积大的细胞往往在此出现），以防染液外溢。
②在血膜上滴加几滴瑞氏染色液,左右晃动，使染液完全覆盖血膜，注意染液不宜过多而溢出界限，亦不能过少而干燥。
③1—2min后，滴加等量磷酸盐缓冲液或生理盐水，2—3min后，可见表面有金属光泽，即可用清水轻轻冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸轻轻吸干。
在正常的情况下，血膜外观染成粉红色。
3）镜检：
先在低倍镜下检查血片，染色是否合格，血细胞分布是否均匀等,然后换高倍镜或油镜观察，并绘图，指出淋巴细胞与白细胞、红细胞。
如自己图片不成功，则对教学片进行观察和绘图。
结果：
血液涂片瑞特氏染色法染色的结果：
中性粒细胞：
是白细胞中数量最多的细胞，胞体大于红细胞，细胞核蓝紫色，呈分叶形，可分2—5叶。
叶间有细丝相连；细胞浆为粉红色，其中充满褐灰色的小颗粒。
嗜酸性粒细胞：
数量少，占白细胞总数的0.5—3%。
胞体较中性粒细胞大，胞核蓝色，颗粒粉红色。
嗜碱性粒细胞：
细胞核蓝紫色，颗粒蓝色。
红细胞数量最大，边缘厚（浓染），中央薄（淡）。
淋巴细胞细胞质天蓝色，细胞核几乎占据整个细胞。
B、姬姆萨染色法：
⑴用甲醇固定标本10分钟，或醋酸：
甲醇=1：
3的混合液固定30分钟。
⑵用滴管吸取姬姆萨染色工作液布满材料面，注意不要有气泡。
⑶染色10——15分钟后，用自来水冲洗，空气干燥，二甲苯透明5分钟。
⑷用光学树脂封片后观察。
结果：
血液涂片姬姆萨染色法染色的结果：
有核细胞的细胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞浆染成粉红色。
无核细胞染成：
C、血液标本片观察结果：
2、练习小白鼠脊椎脱臼处死法。
或用乙醚麻醉致死。
3、仔细解剖小鼠，观察小鼠的内脏器官，找出脾脏、胸腺，分别做触片（3张/组）并用瑞特氏（WrightFs）染色法或姬姆萨染色法染色、观察。
4、观察标本片，绘图描述人、小鼠血液中的几种有形成分。
[结果]
1、脾脏触片瑞特氏染色法染色的结果：
2、脾脏触片姬姆萨染色法染色的结果：
3、标本片观察结果：
实验报告要求：
1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。
2、实验原理、目的要求
3、实验操作记录（实验步骤、结果）
4、分析总结：
依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达到实验目的？
为什么？
5、绘图描述：
人、鼠血液涂片中的淋巴细胞、粒细胞、红细胞
实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法
[实验原理]
抗原免疫动物后，其相应的抗体就会产生并存在于动物的体液中。
血清是体液的重要组成部分，存在大量抗体。
学会了制备血清的方法，就学会了制备抗血清的方法。
红细胞是免疫学反应中常用的颗粒性抗原，也是可溶性抗原的载体及补体结合反应中指示系统的组成成员。
在许多免疫学检测中都要用到红细胞，因此，血清与红细胞的制备技术，是免疫学实验的基本技术。
[目的要求]
1、学习鸡、兔的动脉、静脉及心脏等部位的无菌采血方法；
2、学习动物血清、红细胞的制备方法；
3、掌握离心机的使用方法。
4、解剖鸡、兔，观察免疫器官。
[实验动物]鸡、兔各1只/2组，共需鸡5只、兔5只。
[试剂]
⑴3%来苏儿或3%石炭酸50~100ml/组；
⑵无菌生理盐水150ml/组；分两瓶（100ml/瓶、50ml/瓶）
⑶500单位/ml的肝素溶液2~5ml/班。
[器材]
⑴10ml注射器及针头2支/组；
⑵碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；50-100ml烧杯1个/组；
⑶手术刀、剪、镊子各1把/组；
⑷50~100ml、带玻璃珠的无菌三角烧瓶1个/组（可用20ml链霉素瓶代替）；
⑸无菌试管及试管塞6套/组；离心管2支/组；
（6）离心机1台/6组，共3台；
⑺试管架1个/组、恒温培养箱一个/班、冰箱一个/班。
[操作步骤]
1、兔耳静脉采血（P19）
2、兔耳中央动脉采血（P19）
3、兔心脏采血：
（P18）
4、鸡翼根静脉取血（P19）
5、鸡心脏取血（P18）。
6、离心法制备血清：
取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌的离心管中，平衡离心管，离心10——20分钟/2000—3000rpm。
用毛细滴管吸出血清，将获取的血清分装于已灭菌的小瓶内，加盖并用封口胶将瓶口封住，贴上标签注明血清的名称及制备日期，置低温冰箱中保存备用。
7、沉淀法制备血清：
取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌试管（或平皿）内，加盖置37℃温室内2小时，凝固后用无菌滴管沿试管（或平皿）边缘将血块与皿壁脱离，然后放入4~8℃冰箱中过夜，使血清充分析出。
吸取血清分装于已灭菌的小瓶内备用。
8、动物血红细胞制备：
（1）无菌操作取静脉血，将血注入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振摇数分钟以脱纤维抗凝。
（2）取适量的脱纤维血，用2—5倍无菌生理盐水洗2次，每次2000rpm，离心10分钟，弃上清后用无菌生理盐水配成20%的红细胞悬液，置4℃冰箱保存备用。
作业：
实验报告
1、简述无菌采血应注意哪些事项？
2、离心机操作中应注意哪些问题？
3、血清制备中应注意哪些问题？
4、红细胞制备中应注意哪些问题？
备注：
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉！
实验四血球凝集反应和交叉配血试验
[实验原理]
红细胞等颗粒性抗原与血清中相应的抗体，在适量电解质存在的条件下，经一定时间后，凝集成肉眼可见的凝集物。
抗原抗体的这种反应，称为凝集反应。
在人的ABO血型中，A型血的红细胞上有A抗原，血清中有抗B抗原的抗体；在B型血的红细胞上有B抗原，血清中有抗A抗原的抗体；故A型血的红细胞与B型血的血清混合时，在有电解质存在的条件下就可能发生凝集；同样，B型血的红细胞与A型血的血清混合，在有电解质存在的条件下也可能发生凝集；AB型血的红细胞上，既有A抗原，也有B抗原，而其血清中既无抗A抗原的抗体，也无抗B抗原的抗体；而O型血的红细胞上既无A抗原，也无B抗原，而其血清中既有抗A抗原的抗体，也有抗B抗原的抗体，故AB型血的血清与A型、B型、O型血的红细胞混合，均不会发生凝集，也就是说，AB型血的人能接受A型、B型、O型血液的输血；而O型血的血清与A型、B型、AB型血的红细胞混合，均可能发生凝集；既O型血的人不能接受A型、B型、AB型血液的输血，但他却是万能输血者，其红细胞可以输给任何血型的人。
兔、鸡是否也有相应的血型？
尚不清楚。
本实验可自行设计，在有生理盐水存在的条件下，利用不同组的兔与兔、鸡与鸡、鸡与兔的红细胞和血清的混合，观察凝集现象和溶血现象，并分析、总结实验结果。
[目的要求]
1、将实验三所制备的鸡、兔血清、红细胞分别进行交叉，自行设计，观察鸡与鸡、兔与兔、鸡与兔之间血清与红细胞交互混合，产生的凝集现象和溶血现象。
2、尝试着利用抗原抗体反应的特异性对实验结果进行解释。
[试剂]0.85%生理盐水，100ml/组；5ml注射器2支/组。
[器材]载玻片每人1张、小试管4支/组，毛细滴管2支/每组。
[操作步骤]
1、将制备好的鸡、兔红细胞用生理盐水稀释成0.5%的混悬液。
2、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象：
取1#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入2#、3#兔（鸡）红细胞，用火柴棒混匀，
过10~15分钟，观察，血球凝集现象。
3、兔与鸡（鸡与兔）配血，观察血球凝集现象
取1#、2#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入1#、2#鸡（兔）红细胞，用火柴棒混匀，过10~15分钟，观察，血球凝集现象。
4、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象：
取1#、2#兔（鸡）血清0.5~1ml，加入0.5%的1#、2#鸡（兔）红细胞，混匀，静止过15~20分钟，观察上清液是否溶血（变红），血球是否凝集？
（沉淀物边缘是否整齐）。
5、记录结果
如：
兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象
项目
实验1
实验2
1#兔血清
1滴
-
1#兔红细胞
-
1滴
2#兔血清
-
1滴
2#兔红细胞
1滴
实验结果
凝集（或不凝集）
凝集（或不凝集）
如：
兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象
项目
实验1
实验2
1#兔血清
0.5ml
-
1#兔红细胞
-
0.5ml
2#兔血清
-
0.5ml
2#兔红细胞
0.5ml
实验结果
凝集（或不凝集）
凝集（或不凝集）
溶血（或不溶血）
溶血（或不溶血）
6、总结、分析、讨论。
实验报告
附、玻片凝集反应试验
（ABO血型鉴定试验）
[目的要求]
1、掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途；
2、学习玻片凝集试验结果的观察方法
3、了解ABO血型鉴定的原理，掌握其鉴定方法
[试剂]
1、诊断用人血型抗A血清；
2、诊断用人血型抗B血清；
3、无菌生理盐水
4、消毒液
[器材]
1、凹玻片或载玻片6片/组，
2、无菌刺血针、小试管、尖嘴滴管、毛细吸管、牙签、酒精棉球、无菌干棉球、显微镜各1个/人，每组6人；
3、试管架、记号笔各1个/组。
[操作步骤]
（1）用酒精棉球消毒被检者的指尖或耳垂,用无菌刺血针刺破皮肤,取血1~2滴放入盛有0.5~1ml生理盐水的小试管中,摇匀即成为1%~2%的红细胞悬液。
取血后,用无菌干棉球压迫针眼止血。
（2）取双孔凹玻片一张或载玻片一张,在二孔（或二端）处标明A、B。
用尖嘴滴管分别吸取诊断用人血型抗A和抗B血清,各加一滴于相应的孔内（注意两滴管切勿混用）。
（3）用尖嘴滴管吸取待检红细胞悬液于A、B血清中各加1滴。
（注意勿使滴管尖端和血清接触）。
（4）分别用牙签将抗血清与红细胞悬液混匀（也可前后左右轻轻晃动载玻片使其混匀，用牙签混匀时应分别用两端搅拌,切不可用同一端在A、B两抗血清中搅拌）。
（5）充分混匀后,置室温于实验台上静置10~15分钟后观察有无凝集发生。
如混合液由均匀混浊的红色逐渐变为透明,并出现大小不等的红色凝集块,即为红细胞凝集;若混合液呈均匀分散混浊状,边缘整齐,则为不凝集。
如观察不够清楚,可置显微镜下用低倍镜观察。
血型判定可参照下图及表。
红细胞凝成大块或有数个红细胞凝集在一起为凝集。
用抗血清鉴定血型的结果与判定
血型
抗A血清
抗B血清
A
＋
－
B
－
＋
AB
＋
＋
O
－
－
＋表示凝集，－表示不凝集。
[作业与思考题]
1.你的血型是何型?
你是如何判断的?
…
2.你能接受何种血型的血液?
能输血给何种血型的人?
为什么？
3.根据下表中提供的凝集反应的结果,请将血型检查结果填入表中：
标准A型血清
标准B型血清
待检者血型
＋
＋
－
－
－
＋
＋
－
4.完成下表：
血型
红细胞中的
抗原
血清中的抗体
被凝集的
红细胞类型
输血中能接受的血型
A
B
AB
O
5、如果要检测血清中血型抗体的效价，请你写出主要的操作过程。
备注：
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P77-109
实验五、淋巴细胞的分离与E玫瑰花环形成试验
[目的要求]
1、学习血液中免疫细胞的分离方法。
2、学习E花环试验的操作方法。
3、观察显微镜下E花环的形态。
4、掌握花环计数的方法及其形成原理。
5、了解检测Ea、Et花环的意义。
[材料与试剂]
⑴人外周血：
静脉采血2~4ml，注入盛有2~3滴肝素（500单位/ml）的青霉素瓶中，摇匀。
应在4小时内进行实验。
⑵Alsever＇s保存液
⑶绵羊红细胞（2周内）。
⑷无菌及吸收过的小牛血清：
将小牛血清置56℃水浴经30分钟灭活后，按每毫升小牛血清加入已洗涤过的压积绵羊红细胞0.1ml混匀，置37℃水浴中1小时，然后置4℃冰箱过夜。
以2000rpm离心沉淀10分钟，取上清过滤除菌，分装小瓶，低温保存备用。
⑸无钙、镁Hank′s液；
⑹淋巴细胞分离液，比重为1.077~1.080。
（上海试剂二厂生产，密度P（g/ml）为1.077±0.002，避光低温（4℃）保存，有效期2~3年。
）
⑺0.8%戊二醛，用0.43%NaCl溶液临用前配制。
⑻瑞氏染色液或1%美蓝水溶液。
[器具]
水平式离心机、水浴箱、冰箱、离心管、吸管、试管、内放玻璃珠的三角烧瓶、显微镜等。
[操作步骤]
1.制备淋巴细胞悬液
（1）取1m1淋巴细胞分离液加1ml肝素抗凝血,使血液轻轻覆盖在分离液上面,并使血液与分离液之间保持清晰的界面。
（2）立即置水平式离心机中以2000rpm离心20分钟。
离心后分为四层,最上层为血浆,中间一层为分离液。
上层和中层之间有一乳白色层含有大量淋巴细胞,小量大单核细胞。
最下层为红细胞。
（见图）
（3）用尖嘴滴管小心地吸取淋巴细胞于一试管中,加入无Ca2+、Mg2+的Hank,s液洗涤3次,每次以2000rpm离心10分钟沉淀淋巴细胞,末次洗涤后弃上清,仅留约0.1ml液体,制成淋巴细胞悬液。
细胞计数,用Hank,s液配成5×106/m!
的细胞悬液。
淋巴细胞分离过程
2.绵羊红细胞悬液的制备
取一定量阿氏液保存的绵羊血于离心管中,用无Ca2+、、Mg2+的Harlk′s液洗3次,末次洗涤后取压积的血球用上述Hank,s液配成1%悬液,细胞浓度约为2×108细胞/ml。
3.活性T花环（Ea花环）的形成
（1）取淋巴细胞悬液0.1ml，加入小牛血清0.1ml和0.2ml1%的绵羊红细胞悬液混匀。
（2）于水平式离心机内以500~800rpm离心5分钟,小心吸去上清液,留下约0.1ml液体,立即沿管壁加入一滴0.8%戊二醛溶液固定2~3分钟,轻轻转动试管小心混匀。
（3）加入1~2滴1%美蓝水溶液混匀,取一滴于载玻片上、置油镜下汁数200个淋巴细胞中形成花环的淋巴细胞百分数。
一般以淋巴细胞吸附三个以上绵羊红细胞者为一个花环。
4.总T花环（Et花环）的形成
（1）取淋巴细胞悬液0.1ml加入小牛血清0.1ml及0.2m11%的绵羊红细胞悬液,混匀,置37℃水浴5分钟,其间摇动2次。
（2）500~800rpm离心5分钟,置4℃冰箱2~4小时,吸去少许上清液,约留0.1ml液体,沿管壁加入0.8%戊二醛溶液一滴,固定2~3分钟,轻旋试管以混匀,其余同Ea花环步骤。
[注意事项]
1.必须采用新鲜抗凝血来分离淋巴细胞,从取血到试验最多不超过4小时。
否则,形成E花环的百分数会显著下降。
2.绵羊红细胞的质和量对花环形成有较大的影响。
不新鲜的绵羊红细胞可使花环形成显著减少。
绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以100:
1为宜,比例过低,花环形成明显降低,反之则升高。
3.pH值对花环的形成有影响。
最适pH为7.2~7.40。
过高、过低的pH值可使花环值下降。
4.在制片时需混匀花环悬液,悬浮时一定要轻旋试管,不可用滴管用力吹打或摇动试管,以免形成的花环脱落。
5.镜检时有干片和湿片二种方法。
湿片不能长期保存。
干片是推片法,标本片可长期保存,但推片时花环易脱落,花环形成细胞分布不均匀,推片尾部常高于头部一倍以上。
6.花环形成时,加入蛋白成分可提高花环的稳定性,常用胎牛血清（或小牛血清）,但需先经56℃30J分钟灭活,并用绵羊红细胞吸收,以除去嗜异性抗体,否则此抗体可和绵羊红细胞起反应并吸附于B细胞膜Fc受体上,产生B细胞花环,从而影响试验的准确性。
[作业与思考题]
1.用简明扼要的方式表明Ea和Et花环形成的操作流程。
2.你的实验结果怎样?
请分析试验成败的原因。
3.Ea和Et花环形成时的主要区别是什么?
4.作E花环试验时,为何加入小牛血清?
不用小牛血清用人血清行吗?
加入的小牛血清为什么要经56℃30分钟灭活,并用绵羊红细胞吸收?
备注：
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P179-183
实验六、IgG的分离和纯化
[目的要求]
1、学习动物血清中IgG的分离纯化方法；
2、比较成年牛血清、新生牛血清IgG的含量；
3、了解分离、纯化抗体的原理；
4、熟练掌握离心机的使用方法。
[试剂]
⑴成年牛血清20ml、新生牛血清20ml；
⑵pH7.4、0.01mol/L磷酸盐缓冲液250ml。
⑶pH8.0、0.005mol/L磷酸缓冲液250ml；
⑷饱和硫酸铵溶液500ml；
⑸1%氯化钡250ml。
[器材]
⑴无菌1ml、2ml、5ml、10ml吸管各2支/组；
⑵酒精棉球适量；
⑶离心管2支/组
⑷离心机1台/5组；2-3台/班
⑺试管架1个/组、记号笔1支/组、4℃冰箱1个/班。
[操作步骤]
1.分别取成年牛血清、新生牛血清各2ml（X）于离心管中，加等量的pH7.4、0.01mol/L,磷酸盐缓冲盐水或生理盐水,将血清稀释一倍,慢慢摇动避免形成泡沫。
2.在冰浴中逐滴加入4ml（2X）饱和硫酸铵溶液,边加边搅拌,以防止形成团块,减少沉淀。
此时即有大量的Y-球蛋白沉淀（主要是IgG）。
3.置冰箱静置30分钟或更长时间后,冷冻离心（3000~4000rpm,15分钟）,弃上清。
沉淀用2ml（X）0.01mol/L磷酸盐缓冲盐水溶解。
4.逐滴加入1ml（1/2X）饱和硫酸铵边加边搅拌,使饱和度为33%,置4℃冰箱30~60分钟,离心收集沉淀。
同法重复3、4步骤3次,可得到较纯的IgG。
[作业与思考题]
实验报告
1.分离纯化免疫球蛋白为什么尽可能在低温条件下进行?
所用溶液为何要先冷却?
2.常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有哪几种?
各自得到的纯度如何?
3.五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗?
4.如果用血浆来分离纯化IgG,需不需要去除纤维蛋白原?
5.分离纯化IgG时,为什么硫酸皱的饱和度先调至50%,然后调至33%?
加入硫酸铵溶液时,为什么要一滴滴地加?
6.如果要提取IgA,从初乳中提取是否比从血清中提取合算?
为什么?
7.比较成年牛血清与新生牛血清中IgG含量并分析之。
备注：
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P44-48。
实验七、单向琼脂扩散试验
[目的要求]
1、通过本试验，学习一种抗原定量的测定方法。
2、了解沉淀环的直径与抗原或抗体浓度的关系。
[材料与试剂]
1、3%生理盐水琼脂；
2、正常人血清、已知IgG含量的人血清；
3、羊抗人IgG抗血清；
4、生理盐水；
5、待测羊血清。
[器具]
1、载玻片6张/组；
2、打孔器、微量加样器、湿盒（盒内铺二层湿纱布）、
[操作步骤]
1、溶化3%生理盐水琼脂,并置56℃水浴中保温。
2、稀释抗血清:
将羊抗人IgG抗血清按1/2效价用生理盐水稀释（如效价为1:
60,则稀释成1:
30）,分装于小试管,每管1.5ml，置56℃水浴保温（温度不能高于56℃,且时间不能过长）。
3、.取上述56℃水浴保温的琼脂和抗血清等量混合,小心倾注于置水平台上的载玻片上（勿倒出玻片外!
）。
（板上的抗血清终浓度是多少?
）
4.稀释参考血清:
取参考血清一支,加入蒸馆水0.5时,完全溶解后用生理盐水倍比稀释成1:
10~1:
160五种浓度,并算出IgG的相应含量（严g/ml）。
如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。
参考血清稀释度为1:
10、1:
20、1:
40,则IgG相应含量为1166μg/ml、583
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