2课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.docx
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2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
理一理
判一判
1.选择培养基只允许特定的微生物生长，而抑制或阻止其他微生物的生长。
（√）
2．稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数。
（√）
3．平板划线法只能纯化细菌，不能计数。
（√）
4．从土壤中取样时，土层越浅越好。
（×）
5．来自土壤的微生物稀释倍数越大越好。
（×）
6．测定不同微生物数量时，接种的土壤悬浮液的稀释度相同。
（×）
7．菌落特征是鉴别菌种的重要依据。
（√）
8．以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基。
（√）
9．可用含酚红指示剂的培养基对筛选出的尿素分解菌作进一步鉴定。
（√）
悟一悟
1.可利用分离对象对某种营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该营养物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者，如筛选能分解尿素的细菌，就将尿素作为培养基中的唯一氮源。
2．可利用分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受到抑制，而该分离对象却可大量增殖，在数量上占据优势。
3．显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。
但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来进行活菌数的统计。
4．对照实验中除测试因素（自变量）不同外，其他因素要保证和实验组相同且适宜，并遵循单一变量原则。
5．在培养基制作和保存过程中，都易出现培养基被污染、样品被污染等情况，从而对实验结果造成影响，因此必须要设置空白对照或相互对照。
感悟体会：
练一练
1.[2019·平遥县第二中学高二月考]在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用以尿素为唯一氮源的培养基，乙组实验的培养基中的氮源除尿素外还含硝酸盐，其他成分都相同，在相同条件下操作，培养观察，则乙组实验属于（ ）
A．空白对照B．条件对照
C．相互对照D．标准对照
解析：
生物实验中的实验可以分为空白对照，条件对照，自身对照，相互对照等。
①空白对照是指不给予对照组任何处理的对照；②条件对照是指虽给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；③自身对照是指对照和实验都在同一研究对象上进行。
④标准对照是指生物生理、生化的某些项目也都有相应的标准，将观察测定的实验数值与规定的标准值相比较，以确定其正常与否的对照方法。
理清题目中的实验的相关条件，分析对照实验的类型。
根据以上分析可知，乙组和甲组实验的培养条件不同，形成了条件对照。
综上所述，B正确，A、C、D错误。
答案：
B
2．[2019·新绛县第二中学高二月考]以下关于分解尿素的细菌的说法，正确的是（ ）
A．能分解尿素的原因是能合成分泌蛋白酶
B．以尿素作为唯一的碳源
C．环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性
D．以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红
解析：
能分解尿素是因为可以分泌脲酶，A项错误；筛选分解尿素的细菌时以尿素为唯一氮源，B项错误；该细菌分解尿素的特性是基因控制的，C项错误；以尿素为唯一氮源的培养基中，只有能分解尿素的微生物可以生长，该微生物可以分泌脲酶，把尿素分解成氨，但由于酸碱缓冲液的存在，培养基的pH可以维持稳定，故不会使酚红指示剂变红，D项正确。
答案：
D
3．[2019·贵州省思南中学高二月考]分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（ ）
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂糖 ④不加琼脂糖 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦
解析：
分解尿素的细菌是异养微生物，因此培养基中应该加入有机碳源，如葡萄糖；分离分解尿素的细菌的培养基从功能上属于选择培养基，应该以尿素为唯一氮源；从物理性质上属于固体培养基，因此应加入凝固剂琼脂糖，①③⑤⑧正确；故选C项。
答案：
C
考点1实验原理
1.[2019·贵州省铜仁第一中学高二期中]下列关于统计菌落数目的方法的叙述，正确的是（ ）
A．采用平板计数法获得的菌落数往往多于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．采用平板划线法和稀释涂布平板法都可以对培养基中的菌落进行计数
解析：
平板划线法不能用于计数，用于计数的是稀释涂布平板法，A项错误；当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，B项正确；为了保证结果准确，一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，C项错误；稀释涂布平板法又称活菌计数，是由一个单细胞繁殖形成单个菌落这一培养特征设计的计数方法，可对微生物进行计数，而平板划线法不能用于计数，D项错误。
答案：
B
2．[2019·四川树德中学高二月考]在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。
产生A同学结果的原因可能有（ ）
①土样不同 ②培养基污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③④B．②③④
C．①③④D．①②③
解析：
同一稀释浓度下菌落数不同，产生A同学结果的可能的原因可能是土样不同、培养基污染，或者操作失误，未达到相应的稀释倍数。
答案：
D
3．[2019·广西高二期末]用稀释涂布平板法测定同一土壤样品的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（ ）
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数分别是251和260，取平均值256
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212、256，取平均值163
D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
解析：
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的进行记数，求其平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数。
答案：
D
考点2实验设计
4.[2019·四川高二期末]请选出分离土壤细菌的正确操作步骤（ ）
①土壤取样 ②称取10g土壤，加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1mL进行平板涂布 ④将菌液依次稀释至101、102、103、104、105、106、107倍
A．①→②→③→④B．①→③→②→④
C．①→②→④→③D．①→④→②→③
解析：
分离纯化土壤微生物的正确的操作步骤：
①土壤取样→②制备土壤溶液：
称取10g土壤，加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中→④制备土壤样品稀释液：
将菌液依次稀释至101、102、103、104、105、106、107倍→③涂布平板分离：
吸取0.1mL进行平板涂布。
答案：
C
5．[2019·贵州省铜仁第一中学高二期中]下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，错误的是（ ）
A．该实验需要设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染
B．分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶能分解尿素产生氮气和CO2
C．统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在30～300以内的平板进行计数
D．该实验所用培养基应以尿素作唯一氮源、并加有酚红指示剂鉴定尿素分解菌
解析：
该实验需要设置空白对照组，以检验培养基是否受到杂菌污染，A项正确；分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨和CO2，B项错误；统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在30～300以上的平板进行计数，求其平均值，C项正确；用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红，D项正确。
答案：
B
6．[2019·吉林白城一中高二月考]在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是（ ）
A．筛选出能分解尿素的细菌
B．对分离的菌种作进一步鉴定
C．作细菌的营养成分
D．如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素
解析：
尿素分解菌可以产生脲酶将尿素分解分解为氨，使pH升高，培养基中加入酚红指示剂后，氨可以使指示剂呈红色，据此可以用酚红指示剂鉴别尿素分解菌。
答案：
B
7．[2019·湖北高二月考]可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（ ）
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入伊红—美蓝试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
解析：
在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。
若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红，A项正确；伊红美蓝试剂是鉴定大肠杆菌的，不能分离出分解尿素的细菌，B项错误；苏丹III试剂是鉴定脂肪的，不能分离出分解尿素的细菌，C项错误；双缩脲试剂是鉴定蛋白质的，不能分离出分解尿素的细菌，D项错误。
故选A项。
答案：
A
8．人和哺乳动物的尿中含有尿素，环境中大量尿素的存在会造成污染。
土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。
某研究小组对土壤中的这类细菌进行分离，用以回收氮源，同时可净化环境。
请回答下列相关问题：
（1）分离培养细菌时必须进行无菌操作。
配制培养基时，灭菌与调节pH的先后顺序是________。
（2）采用________________法将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养。
在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在________旁进行操作。
（3）用________________培养基筛选获得能分泌脲酶的细菌，从功能上划分该培养基属于________培养基。
若培养基中存在能分泌脲酶的细菌，其菌落周围会出现________，这是由于尿素被分解产生________，遇培养基中加入的酚红指示剂产生的颜色变化，从而证明这一菌株可以尿素为氮源。
变色区域越大，表明该菌株利用尿素的能力________。
解析：
（1）配制培养基时，应先调pH，后灭菌，灭菌后再调节pH可能导致培养基的污染。
（2）将样液进行一系列的梯度稀释，应采用稀释涂布平板法接种，然后培养。
在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在酒精灯火焰旁进行操作，以避免污染杂菌。
（3）获得能分泌脲酶的细菌，可以用以尿素为唯一氮源的培养基筛选，从功能上划分该培养基属于选择培养基。
若培养基中存在能分泌脲酶的细菌，尿素被分解后产生氨，可以使培养基中加入的酚红指示剂产生红色，使菌落周围出现红色圆环，从而证明这一菌株可以尿素为氮源。
变色区域越大，表明该菌株分解的尿素越多，利用尿素的能力越强。
答案：
（1）先调pH，后灭菌
（2）稀释涂布平板 酒精灯火焰 （3）以尿素为唯一氮源 选择 红色圆环现象 氨 越强
9．[2019·黑龙江大庆实验中学高二期末]某研究小组从牛的瘤胃中采集样本，进行分解尿素的微生物的分离与计数。
实验基本步骤如下，请回答下列问题：
→
→
→
→
（1）分解尿素的微生物含有________________，因此，配制培养基时以尿素作为唯一氮源，尿素会被分解成________使培养基的碱性增强。
培养基中添加________作为指示剂，可使目标菌落的周围产生红色环带。
（2）该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是____________；然后将1mL瘤胃样液稀释1000倍，在3个平板上用涂布平板法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为49、47和45。
据此可得出每升瘤胃样液中分解尿素的微生物活菌数为________，理论上，统计的菌落数________（低、等、高）于接种的实际活菌数目。
解析：
（1）分解尿素的微生物含有脲酶（分解尿素的酶），因此，配制培养基时以尿素作为唯一氮源，尿素会被分解成氨（NH3）使培养基的碱性增强；培养基中添加酚红作为指示剂，可使目标菌落的周围产生红色环带。
（2）接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成，用来进行对照，以检测培养基平板灭菌是否合格；根据题意可知，3个平板上生长的平均菌落数C＝（49＋47＋45）÷3＝47个，涂布平板时所用的稀释液的体积V＝0.1mL，稀释倍数M＝103，所以每毫升瘤胃样液中分解尿素的微生物活菌数为（C÷V）×M＝（47÷0.1）×103＝4.7×105个，则每升瘤胃样液中分解尿素的微生物活菌数为4.7×105×103＝4.7×108个。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，理论上，统计的菌落数往往低于接种的实际活菌数目。
答案：
（1）脲酶（分解尿素的酶） 氨（NH3） 酚红
（2）检测培养基灭菌是否合格 4.7×108 低
一、选择题
1．[2019·北京四中高二期中]“分离土壤中以尿素为氮源的微生物”实验，配制LB全营养培养基的目的是（ ）
A．作为实验组，分离尿素分解菌
B．作为对照组，检测培养基灭菌是否彻底
C．作为对照组，观察尿素分解菌在含有酚红培养基上的菌落形态
D．作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数量
解析：
“分离土壤中以尿素为氮源的微生物”实验，应设置实验组和对照组，实验的变量是培养基的不同，故实验组应配置以尿素为唯一氮源的培养基，属于选择培养基，对照组为全营养培养基，因此，配制LB全营养培养基的目的是作为对照组，观察全营养条件下能生长的土壤微生物的种类和数目，以区分选择培养基是否有选择作用，D项正确。
答案：
D
2．在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。
下列有关叙述，出现科学性错误的是（ ）
A．甲同学出现这种结果的原因可能是由于土样不同，也可能是操作过程出了问题
B．可以将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染
C．将其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学无误
D．B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
解析：
甲同学获得的菌落远大于其他同学，可能是由于所取的土样不同，也可能操作过程被污染，A项正确；污染可能是培养基灭菌不彻底，或操作过程没有保证无菌操作，将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，B项正确；若是土样不同造成的，让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学操作正确，C项正确；B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复性原则，D项错误；故选D项。
答案：
D
3．[2019·四川阆中中学高二期中]下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是（ ）
A．分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生氮气
B．在稀释度足够高时，所形成的单个菌落一定是由最初的一个细胞繁殖而来的
C．统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数
D．用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红
解析：
分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生二氧化碳和氨气，A项错误；在稀释度足够高时，所形成的单个菌落可能是由最初的一个细胞繁殖而来的，也可能几个细胞未分开，繁殖形成一个菌落，B项错误；统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在30～300以内的平板进行计数，C项错误；用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红，D项正确。
答案：
D
4．[2019·四川雅安中学高二月考]分离土壤中尿素分解菌的实验操作中，无法分离得到尿素分解菌的原因最可能是（ ）
A．制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B．未对土壤样液进行稀释就进行涂布培养
C．牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D．接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
解析：
制备浸出液的土壤取自土壤的表层与纯化的尿素分解菌的单菌落有关，但影响不大，A项不符合题意；未对土壤样液进行稀释，土壤样液中的尿素分解菌浓度大，容易分离得到尿素分解菌，B项不符合题意；该培养基必须以尿素为唯一的氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基或在其中添加尿素作为氮源，否则大量的微生物都能生长，该培养基就无法起到选择的作用，即无法分离得到尿素分解菌，C项符合题意；接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒，可能会造成污染，但对分离尿素分解菌影响不大，D项不符合题意。
答案：
C
5．[2019·河南省开封市第十中学高二月考]下列可以鉴定分解尿素的细菌的方法是（ ）
A．在加入尿素及其他氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
C．在加入尿素及其他氮源的培养基中加入伊红—美蓝试剂
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入伊红—美蓝试剂
解析：
筛选尿素分解菌应采用以尿素为唯一氮源的选择培养基。
培养基中加入酚红指示剂，尿素分解为氨时，培养基的pH升高，使酚红指示剂将变红。
综上所述，鉴定分解尿素的细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，B项正确，A、C、D三项错误。
故选B项。
答案：
B
二、非选择题
6．[2019·吉林市第三中学高二月考]下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基配方：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4g
2.1g
0.2g
10.0g
1.0g
15.0g
蒸馏水定容至1000mL。
请根据以上配方，回答下列问题：
（1）该培养基含有微生物所需要的________类营养物质。
其中最主要的碳源是________，唯一的氮源是________。
（2）该培养基按物理性质划分是________培养基，按培养基的作用划分是________培养基。
（3）培养基配制完成后，一般还要调节pH并对培养基进行________处理。
解析：
（1）该培养基中含有水、无机盐、碳源和氮源4类营养物质，其中最主要的碳源是葡萄糖，唯一的氮源是尿素。
（2）该培养基是加入琼脂的固体培养基，且以尿素为唯一氮源，能够筛选出分解尿素的细菌，属于选择培养基。
（3）培养基配制完成后，一般还要调节pH并对培养基进行灭菌处理。
答案：
（1）4 葡萄糖 尿素
（2）固体 选择 （3）灭菌
7．[2019·河南高考模拟]某些细菌可将尿素分解成CO2和NH3。
欲从土壤中分离能分解尿素的细菌，某研究小组利用成分为KH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、琼脂、尿素的培养基进行了相关实验。
请回答：
（1）在土壤微生物的培养过程中，培养基中的KH2PO4与Na2HPO4作为无机营养被细菌利用外，它们还具有的功能为__________________________________________；葡萄糖的作用是____________________________________________。
（2）该培养基对土壤中的微生物具有选择作用，理由是__________________________________________________________。
微生物能分解尿素的原因是这些微生物能合成________。
（3）为能获得目的菌的单菌落，常对土壤样液做________处理。
为便于确认目的菌，可在培养基中加入________指示剂，接种并培养后，可根据菌落周围________来判断该菌能分解尿素。
解析：
（1）培养基中的KH2PO4与Na2HPO4除作为无机营养被细菌利用外，它们还具有的功能为：
KH2PO4和Na2HPO4可构成缓冲液，维持培养基的pH相对稳定，利于微生物的生长与增殖。
葡萄糖是细胞主要的能源物质，可为细菌的代谢提供能量，还能为合成其他有机物提供原料。
（2）该培养基中的唯一氮源为尿素，只有以尿素为氮源的细菌才能在此培养基上生长、增殖，所以该培养基对土壤中的微生物具有选择作用。
微生物能分解尿素的原因是这些微生物能合成脲酶，脲酶可将尿素分解为氨。
（3）为能获得目的菌的单一菌落，常用无菌水对土壤样液做稀释处理。
尿素分解菌合成的脲酶可将尿素分解形成氨，氨使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红。
所以为便于确认目的菌，可在培养基中加入酚红指示剂，接种并培养后，可根据菌落周围出现红色来判断该菌能分解尿素。
答案：
（1）能使培养基的pH保持相对稳定，利于微生物的生长与增殖 为细菌的代谢提供能量，为合成其他有机物提供原料
（2）该培养基中的唯一氮源为尿素，只有以尿素为氮源的细菌才能在此培养基上生长、增殖 脲酶
（3）稀释 酚红 出现红色
8．[2019·贵州高二期中]下面是尿素分解菌所用的培养基，根据下表回答下列问题：
Na2HPO4
K2HPO4·
7H2O
MgSO4
葡萄糖
尿素
琼脂
蒸馏水
2.1g
1.4g
0.2g
10.0g
1.0g
15.0g
定容至
1000mL
（1）该培养基按照物理性质来分，属于________培养基；该培养基具有选择作用的原因是__________________________________________________________。
（2）鉴定某种细菌是否能够分解尿素，可向培养基中加入________指示剂。
若该细菌能分解尿素，则指示剂变________色，所依据的原理是________________________________________________________。
（3）如果对尿素分解菌进行分离和计数，可以采用________________________法接种。
（4）为了保持菌种的纯净，对于长期需要保存的菌种，可以采用________的方法。
解析：
（1）由于培养基中有琼脂，故按照物理性质来分，该培养基属于固体培养基；该培养基中尿素作为唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能在此培养基上生长繁殖。
（2）在细菌分解尿素的过程中，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨溶于水使培养基pH升高，遇酚红指示剂变红，所以在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂后，若指示剂变红，说明菌体能合成脲酶分解尿素。
（3）微生物计数时常用稀释涂布平板法接种。
（4）根据分析可知，菌种的长期保存常使用甘油管藏法。
答案：
（1）固体 该培养基中以尿素为唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能在此培养基上生长繁殖
（2）酚红 红 在细菌分解尿素的过程中，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨溶于水使培养基pH升高，遇酚红指示剂变红
（3）稀释涂布平板
（4）甘油管藏法
9．[2019·广西高考模拟]尿素是一种重要的农业氮肥，但是尿素不能被农作物直接吸收，只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。
请回答问题：
（1）土壤中的某些细菌能分解尿素，是因为它们能合成________。
（2）配制好的培养基常用________法进行灭菌。
为了检测所用培养基平板灭菌是否合格，需要进行的操作是________________________________________。
（3）为了筛选到能分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，原因是______________________________________________________；若平板上长出菌落，可通过加入显色剂初步鉴定该种细菌能够分解尿素，加入的显色剂是________。
（4）一位同学在某浓度下稀释涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
该同学的实验结果________（填“是”或“否”）具有说服力，原因是______________________。
解析：
（1）土壤中的某些
升级会员 