基因工程实验讲义.docx
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基因工程实验讲义
动物DNA制备
一、实验目的
了解动物基因组DNA的提取原理和基本操作步骤，掌握从动物组织样品中制备高质量基因组DNA的方法。
二、实验原理
在EDTA和SDS等去污剂存在的条件下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，无水乙醇沉淀，可以得到动物基因组DNA。
用此方法得到的DNA长度大约在100-200kb之间，适用于PCR扩增、基因组文库构建和Southern杂交等实验分析。
三、实验材料
新鲜的动物组织。
四、实验仪器
高压灭菌锅，玻璃匀浆器，恒温水浴锅，台式高速冷冻离心机
五、试剂配制
1、组织匀浆液
100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl（pH8.0），25mmol／LEDTA（pH8.0）
2、蛋白酶K溶液
按10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20℃保存。
3、裂解缓冲液
200mmol／LNaCI，20mmol／LTris·HCI（pH8.0），50mmol／LEDTA（pH8.0），1%SDS。
4、不含DNA酶的RNA酶溶液
将胰RNA酶溶解于10mmol／LTris·HCl（pH7.5）、15mmol／LNaCl溶液中，RNA酶溶液的终浓度为l0mg／mL。
将酶液置于100℃水浴处理15min，使DNA酶失活，缓慢冷却到室温，-20℃保存。
5、Tris饱和酚（pH8.0）：
氯仿：
异戊醇混合液
酚：
氯仿：
异戊醇按体积比25：
24：
1配制，现配现用。
6、TE缓冲液
10mmol／LTris·HCl（pH8.0），1mmol／LEDTA（pH8.0），配制完成后高压灭菌，4℃保存。
六、实验步骤
（一）DNA的提取
1、组织样品的处理
切取新鲜的（或冷冻的）动物组织1g，除去结缔组织，用预冷至4℃的生理盐水清洗3次；在冰浴中剪碎后，置于玻璃匀浆器，加入约2.0mL组织匀浆液匀浆至无明显组织块存在。
2、细胞裂解
将组织细胞移至2.5ml离心管中，设定在4℃条件下5000r/min离心30-60s，弃上清液；向沉淀细胞中加入等体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K溶液至终浓度200µg／mL，翻转混匀（动作一定要轻柔）后于55℃水浴中缓慢振荡处理12-18h。
在混合物中加RNA酶溶液至终浓度200µg／mL，37℃水浴1h。
3、酚／氯仿法抽提
裂解处理后的混合物中加入等体积的酚／氯仿／异戊醇（25：
24：
1）混合液，缓慢旋转摇匀5min后4℃10000r/min离心10min；用宽口径吸管谨慎地吸取上层水相，转移至另一离心管中（注意勿吸出界面中蛋白沉淀），加等体积氧仿／异戊醇（24：
1），4℃10000r/min离心10min。
如果界面或水相中蛋白含量较多，可重复操作2-3次。
4、乙醇沉淀
用宽口径吸管小心吸出上层含DNA的水相，转移至离心管中加1／10体积的3mol／L醋酸钠溶液使终浓度达到0.3mol／L，再向每管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，-20℃过夜。
12000r/min离心10min，弃上清液；75%的预冷乙醇洗涤一次，12000r/min离心10min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。
5、DNA的溶解与保存
在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液（100-200µl），存放于4℃，轻摇溶解过夜。
DNA溶液分装后通常4℃保存备用，如果需要长期保存，应在-20℃以下保存。
（二）、紫外吸收法检测DNA浓度和质量
DNA分子中的嘌呤环和嘧啶环能够很好地吸收260nm附近的紫外光，因而可以利用紫外吸收的方法测定DNA浓度和质量。
1µg／mLDNA溶液在260nm波长下的吸光值（OD260）为0.02，当OD260=1.0时，样品的浓度则为50µg／mL。
记录紫外分光光度计上测得的吸光值OD260，按以下公式计算待检DNA样品的浓度：
DNA样品的浓度（µg／mL）=50×OD260值
蛋白质对紫外光吸收的高峰在280nm处，如果蛋白质清除得比较彻底，则待检DNA样品的OD260／OD280应在1.8左右。
如果测得的比值大大低于1.8，则说明样品中还存在着较多的蛋白质，如果测得的比值大大高于1.8，则说明样品中还存在着较多的RNA。
酚对紫外光吸收的高峰在270nm处，如果测得的OD260／OD270比值在1.2左右，则表明样品中不含酚。
盐和小分子对紫外光吸收的高峰主要集中在230nm处，OD260／OD230的比值应在0.4-0.5之间，如果比值较高说明有残余的盐存在。
【注意事项】
植物DNA的制备
一、实验目的
学习从植物组织中提取总DNA的原理和技术，掌握常用的不同提取方法，并进一步比较它们的异同点。
二、实验原理
采用液氮冷冻后破碎植物细胞壁的方法破碎细胞。
破碎的细胞悬浮于裂解液中，其中含有的离子型表面活性剂SDS能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出；EDTA螯合二价金属离子以抑制DNA酶的活性。
再经酚、氯仿、异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀后析出较纯的DNA。
三、实验材料
新鲜或冷冻的植物叶片。
四、实验仪器
高压灭菌锅，研钵，恒温水浴锅，台式高速冷冻离心机
五、试剂配制
1、裂解缓冲液
100mmol／LTris·HCl（pH8.0），20mmol／LEDTA（pH8.0），500mmol／LNaCl，1.5%SDS。
2、TE缓冲液
10mmol／LTris·HCl（pH8.0），1mmol／LEDTA（pH8.0），配制完成后高压灭菌，4℃保存。
六、实验步骤
1、取5g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状，做到尽可能研得越细越好。
2、将粉末转移至50ml离心管中，待液氮蒸发后，加入20ml裂解缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温20min。
3、从水浴中取出离心管，加入5ml5mol／LKCl溶液，混匀，水浴20min。
4、将混合物50000r/min离心20min，上清液转移到另一50ml离心管中。
5、加等体积氯仿／异戊醇（24∶1）混匀，12000r／min离心5min，取上清液。
6、加等体积氯仿，混匀，12000r／min离心5min，取上清液。
7、加入2.5体积预冷的无水乙醇，充分混匀，12000r／min离心5min沉淀DNA。
9、获得的DNA沉淀用75%乙醇以12000r／min离心洗涤10min，重复洗涤2次。
10、离心收回的DNA沉淀室温下自然风干，等乙醇挥发干净，向沉淀中加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。
11、植物DNA浓度和质量检测与动物DNA分子的相同。
【注意事项】
DNA分子的纯化
【实验目的】
在了解DNA分子纯化原理和方法的基础上，掌握实验室常用DNA分子纯化方法的操作技术。
【实验原理】
纯化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉淀法，适用于普通实验室操作。
它通过交替使用苯酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以增加去除蛋白质杂质的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，还可以加快有机相与液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
【实验材料】
待纯化的DNA溶液。
【实验仪器】
高压灭菌锅，涡旋混匀器，台式高速冷冻离心机
【试剂配制】
1、Tris饱和酚（pH8.0）：
氯仿：
异戊醇混合液
酚：
氯仿：
异戊醇按体积比25：
24：
1配制，现配现用。
2、氯仿：
异戊醇混合液
氯仿：
异戊醇按体积比24：
1配制，现配现用。
3、醋酸钠溶液
配制3mol／L的醋酸钠溶液，调节pH值至5.2。
4、TE缓冲液
10mmol／LTris·HCl（pH8.0），1mmol／LEDTA（pH8.0），配制完成后高压灭菌，4℃保存。
【实验步骤】
1、在待纯化的DNA溶液中加等体积的酚：
氯仿：
异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀。
2、将混合物12000r／min离心10min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中。
如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则需要重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物。
3、向上层水相中加入等体积的氯仿：
异戊醇（24：
1）混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000r／min离心10min。
4、移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1／10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20℃保存30min。
5、12000r/min离心5min，弃上清液；75%的乙醇12000r/min离心洗涤5min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。
6、在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20℃以下长期保存。
【注意事项】
PCR基因扩增
【实验目的】
掌握PCR反应的基本工作原理和实验技术。
【实验原理】
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。
整个扩增过程分三步：
①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。
完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。
经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。
【实验材料】
模板DNA溶液，4种dNTP，上游引物和下游引物，Taq聚合酶（1U／µL）。
【实验仪器】
PCR扩增仪，移液器，涡旋混匀器，台式离心机，凝胶电泳系统，紫外检测仪
【试剂配制】
1、10×缓冲液
500mmol／LKCl，100mmol／LTris·HCl（pH8.3），15mmol／LMgCl2，0.1%明胶。
2、4种dNTP混合液
1mmol／LdATP，1mmol／LdCTP，1mmol／LdGTP，1mmol／LdTTP。
3、上游引物和下游引物
上游引物和下游引物的溶液浓度都是稀释至10pmol／µL。
4、模板DNA溶液
稀释至100ng／µL的模板DNA溶液。
【实验步骤】
一、在PCR薄壁管中配制50µL标准反应体系
在PCR薄壁管中依次加入反应所需要的各种溶液，低速离心沉入管底后用涡旋混匀器充分混合，最后在薄壁管中加入50µL石蜡油覆盖反应液。
50µL标准反应体系中包含的溶液如下：
反应物
体积/µL
10×缓冲液
5
2.5mmol／LdNTP
25mmol／LMgCl2
上游引物
2
下游引物
2
模板DNA
1
Taq聚合酶
2
ddH2O
二、PCR扩增过程
将加入反应混合液的薄壁管置于PCR扩增仪中，按照设定的程序扩增。
扩增程序为：
94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，重复30-35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
三、PCR扩增效果的检测
按照设计的扩增目标片段大小，配制一定浓度的琼脂糖凝胶；然后取10µL扩增产物电泳检测，紫外检测仪中观察结果。
【注意事项】
琼脂糖凝胶电泳技术
【实验目的】
理解电泳的基本原理，学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
【实验原理】
在琼脂糖凝胶中，DNA分子具有电荷效应和分子筛效应。
在高于等电点的溶液中，DNA分子由于带负电荷而在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系，具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不同，从而能够将不同大小的DNA片段在凝胶上分离。
DNA分子的迁移率还与分子的高级结构有着密切的关系，即凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
因此，选用已知相对分子质量的线性DNA标准分子量参照物作对照，通过在电泳凝胶中迁移率的比较，可以大致推测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
琼脂糖凝胶电泳是一种操作简单、快速分离DNA分子的常用方法，其有效分离范围在0.1kb-60kb之间，在实验中要根据需要选用合适的琼脂糖凝胶浓度。
不同琼脂糖凝胶浓度及其分辨力比较
琼脂糖凝胶浓度（%）
可分辨的线性DNA分子大小范围（kb）
0.3
5-60
0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-4
2.0
0.1-3
【实验材料】
基因组DNA或酶切基因组后获得的DNA片段或其它方式获得的DNA分子。
【实验仪器】
微量进样器，电泳装置，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶电泳成像系统
【试剂配制】
1、5×TBE电泳缓冲液
Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol／LEDTA（pH8.0）20mL，加水定容至1000mL，作为母液保存，使用时稀释为0.5×TBE或1×TBE电泳缓冲液。
2、6×上样缓冲液
0.25%（W／V）溴酚蓝与40%（W／V）蔗糖水溶液混匀，4℃保存，可长期使用。
3、溴化乙锭（EB）显色液
先配制成1mg／mL母液4℃避光贮存，使用前稀释为1µg／mL。
【实验步骤】
一、制备凝胶
1、清洗电泳槽、制胶板、制胶床和梳子，晾干备用。
2、将制胶板置于水平台面上的制胶床中，插入梳子（梳子的梳齿可根据实验需要选择合适大小）。
3、称取一定量的琼脂糖粉末倒入三角烧瓶中，加入1×TBE缓冲液，轻轻地摇动三角烧瓶，使琼脂糖粉末呈均匀混合状态，并在微波炉中加热熔化至透明的水样琼脂糖凝胶液。
4、水样琼脂糖凝胶液自然冷却到60℃左右时，缓慢倒入准备好的胶床内，使之形成均匀的胶面（凝胶厚度通常为0.3-0.5cm），注意尽量不要产生气泡。
如果有气泡，趁热用捻细的吸水纸赶出。
5、室温下静置约30min左右，待凝胶完全凝固后，拔出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中。
6、向电泳槽中加入1×TBE作为电泳缓冲液，液面以完全浸没胶面0.2cm为宜。
二、电泳样品的处理和上样
1、在待检测的DNA样品中加入约为样品1／6的上样缓冲液，用微量进样器混匀后加入到凝胶的样品孔中。
每个样品孔中的进样量不宜过多，以防溢出后出现DNA样品交叉污染。
2、DNA标准分子量参照物按使用说明书进样。
3、记录进样样品的次序和进样量。
三、电泳
1、接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，进样孔应在负极，使得DNA片段从负极向正极移动），通电开始电泳。
为防止样品扩散，在样品进入凝胶前可用略高的电压；当样品进入凝胶后，一般控制最高电压不超过5V／cm（电压值V／电泳槽正负两极之间的距离cm）。
2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处时，停止电泳。
四、染色观察与拍照
1、小心地取出凝胶，移入装有1×TBE缓冲液的平皿中，滴入2-3滴1µg／mL溴化乙锭溶液，浸泡约30min左右；用蒸馏水冲洗两遍后置于紫外检测仪下观察结果。
2、溴化乙锭溶液浸泡显色后的凝胶也可直接置于凝胶电泳成像系统中拍照保存结果。
【注意事项】
DNA的电泳分离和回收
【实验目的】
了解从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的原理与方法，掌握低熔点琼脂糖法回收目的片段的实验技术。
【实验原理】
低熔点琼脂糖是经过羟基修饰的琼脂糖，其链间氢键数目小于普通琼脂糖，能够在比普通琼脂糖更低的温度上熔化或凝固。
一般熔点为65℃，低于双链DNA的解链温度，这一特性是从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基础。
在电泳凝胶中，不同大小的DNA片段分离处于不同的位置，将凝胶条切下并回收含目的片段的凝胶，凝胶经熔化后抽提、浓缩即可被分离回收，该方法回收大小在0.5-5kb之间的DNA片段效果最佳。
【实验材料】
DNA溶液，Eppendorf管，Tip头。
【实验仪器】
超净工作台，移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，紫外检测仪
【试剂配制】
1、5×TBE电泳缓冲液
Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol／LEDTA（pH8.0）20mL，加水定容至1000mL，作为母液保存，使用时稀释为0.5×TBE或1×TBE电泳缓冲液。
2、6×上样缓冲液
0.25%（W／V）溴酚蓝与40%（W／V）蔗糖水溶液混匀，4℃保存，可长期使用。
3、溴化乙锭（EB）显色液
先配制成1mg／mL母液4℃避光贮存，使用前稀释为1µg／mL。
【实验步骤】
DNA凝胶的纯化、回收（VitageneDNA凝胶回收试剂盒）
1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶。
2、根据凝胶浓度加适当体积的DE-A溶液，混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于45℃加热），间断混合，直至凝胶完全溶化（约6－8min）。
3、加0.5个DE-A体积的DE-B溶液混合均匀。
4、吸取C中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管中），3600rpm离心1min，弃滤液。
5、将制备管置回离心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。
6、将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。
以同样的方法再用0.7mlW2溶液洗涤一次。
7、将制备管置于离心管中，最高速度离心1min。
8、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备管膜正中央加25ul水或洗脱液，室温静置1min，最高速度离心1min洗脱DNA。
试剂盒使用注意：
以上操作步骤适于从TAE或TBE琼脂糖凝胶中提取DNA.从其他缓冲液电泳胶中提取DNA时，加入DE-B溶液后，溶液的pH应调整到6.5以下。
在步骤A中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶溶化时间（线性DNA长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。
勿将DNA的凝胶长时间的暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。
步骤B中凝胶必须完全溶化，否则将严重影响DNA回收率。
洗脱液或水加热至60℃，有利于提高洗脱效率。
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至10ugDNA（100bp-150kb），回收率为70%-90%。
【注意事项】
DNA重组技术－酶切
【实验目的】
了解常用限制性核酸内切酶的特性，学习设计酶切方案的一般原则和原理，掌握酶切的实验室操作技术。
【实验原理】
DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用连接酶将其连接，构成新的DNA分子。
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。
根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。
【实验材料】
基因组DNA溶液。
【实验仪器】
高压灭菌锅，恒温水浴锅，台式离心机，凝胶电泳系统，紫外检测仪
【试剂配制】
1、10×Buffer混合液（见购买的内切酶的说明书）
2、TE缓冲液
10mmol／LTris·HCl（pH8.0），1mmol／LEDTA（pH8.0），配制完成后高压灭菌，4℃保存。
【实验步骤】
1、配制酶切反应体系。
在200μl指形管中加入以下体系：
10×Buffer2μl
去离子水16μl
EcoRI酶1μl
DNA模板1μl
2、将加入的反应液充分混匀后置于37℃水浴2h。
3、将反应液置于65有℃水浴反应20min，终止酶切反应。
4、取酶解液5μl进行琼脂糖电泳检测效果。
【注意事项】
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