农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立Word格式.docx
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中运用最为广泛而有效的遗传转化系统，因此有许多学者尝试将这一体系用于水稻的
基因转化（李宝健等1990，Li等1992，Chan等1993）。
Raineri等（1990）曾报告
用农杆菌转化水稻得到转基因细胞并证明了T-DNA上的NPT?
基因和GUS基因在受体细胞中的整合与表达。
Chen等（1993）利用农杆菌法获得了一些转基因水稻植株，
Southern杂交证明T-DNA上的基因传递给了后代。
由于当时转化效率还很低，加之
一些报告缺乏必要的分子证据或分析数据，因此人们对农杆菌转化法尚有疑问
（Potrykus1990）。
近年来，在根瘤农杆菌转化单子叶植物方面取得了长足的进步。
水稻是单子叶植物基
因组研究的模式植物,近年来水稻基因组研究取得了很大进展,构建了遗传图谱和物
理图谱,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测序,以及第1号和第4号染色体的精细测序,并对第10号染色体的结构进行了详细分析。
Hiei等（1994）报告利用根瘤农杆菌转化粳稻得到大量转基因植株,并提供了详细的分子生物学证据；
Rashid等.dong等.Aldemitahodges以及Ishida等于1996年利用Hiei（1994）的转化体系分别在籼稻.爪哇稻.籼粳稻和玉米上获得转基因植株,再次证明根瘤农杆菌介导转化水稻
的可行性和有效性。
本研究利用农杆菌LBA105为测试菌，通过改进和优化冷冻法转化条件，并结合氯
化钙法或TSS法制备感受态细胞，通过分析比较细胞生长状态，重悬液浓度，冻融时
间，热处理温度等条件对农杆菌转化效率的影响，筛选出了方法简单.步骤简便。
易操作，并具有较高转化率的实验方案。
最后将携带有报告基因质粒PBI121和GFP外源
OryzasativaL.ssp.jap基因的农杆菌EHA105转入以水稻基因组测序品种日本晴（
）水稻中，探索建立起水稻的遗传转化体系。
onica
大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株EHA105,质粒GFP
（携带绿色荧光蛋白基因GFP）和质粒PBI121（携带β-葡萄糖苷酸酶基因GUS）均
由本实验室保存。
PEG4000分析纯；
DMSO，分析纯；
Cacl2,分析纯;
Mgcl2,分析
纯;
Nacl分析纯;
j均为西安化学试剂厂产品。
利福平（Rif）:
工作浓度为50mg/L,卡
那霉素（kan）:
工作浓度为50mg/L，均为Sigma产品。
台式高速离心机（Eppendorf）,Centrifuge6900型离心机,数显振
荡培养厢，TU-1800型紫外可见光分光光度计（北京美菱），超净工作台（江苏），
WD-9403型紫外分析仪，KUBOTACorpora2tionJapan;
PCR仪,PCRSystem270型,Singapore;
电泳仪（北京鼎国1100型）,GeneGenuis型GYNGENE,UK。
1.1.4.1溶液
TE:
Tris-HCL10mmol/L,1mmol/LEDTA,PH8.3。
.2STE:
0.1mol/LNaCL,10mmol/LTrisPH8.0,1mmol/LEDTAPH8.0。
.溶液?
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCL（PH0.8）,10mmol/LEDTA（PH0.8）,用前TSS：
10％PEG，5％DMSO,20mmol/LMgcl
配制，各成分配成母液，灭菌保存。
溶液?
0.2mol/LNaOH（10mol/l贮存液）,1?
SDS,用前配制。
溶液?
5mol/LKAc60ML,冰醋酸11.5Ml，加蒸馏水定容至100mL，所配制溶液含
3mol/LK?
5mol/LAc?
。
1.1.4.2培养基
愈伤诱导培养基（Callusinductionmedium）
MS基本培养基（工作浓度mg/L）：
PH5.8
KNO上微）1900MnSO.2HO16.9Cocl.6HO0.0234222大量元同
5NHNO163543素微
量有MgSO370ZnSO.7HO8.6Gly2.0442元机素元KHPO170HBO6.2维生素B10.12433素
钙盐CaclHO440KI0.83维生素B60.52.2
Fe盐Na-EDTA37.3NaMoO.2HO0.25烟酸0.5242
FeSO.4HO27.8CuSO.5HO0.025肌醇1004242
N6D基本培养基（工作浓度mg/L）：
250mlPH5.8
（NH）SO2.5mlMgSO2.5mlVitamin2.5ml4244
KHPO2.5mlFe?
-EDTA2.5mlNominstock2.5ml242
solutionCacl2.5ml肌醇2.5ml2,4-D（mg/mg）0.625ml2
KNO0.71gSucrose7.5gPro0.2g3
）SO0.5mlVitamin1ml水解物0.03g424水解物0.075gphytagel0.75gKH1/2N6D基本培养基：
100mlPH5.2PO0.5mlNominstock0.5mlphytagel0.3g24
solution（NH
Cacl0.5ml2,4-D（mg/ml）0.25mg葡萄糖1g2
MgSO0.5mlKNO0.142gAS（ul）100g43
Fe?
-EDTA1mlSucrose2g2
肌醇1mlPro0.2gLB培养基：
1LPH7.0
胰蛋白胨10g酵母提取物5gNacl10gYEB培养基：
PH7.0
胰蛋白胨5g/LSucrose5g/L酵母提取物1g/LMgSO
0.5g/L4
水稻愈伤组织的诱导参照Hiei等[7]的方法。
将日本晴水稻（OryzasativaL.
ssp.japonica）种子脱去内颖和外颖,每200粒种子为1个处理,用蒸馏水清洗3次，然后用体积分数75%乙醇浸泡2分钟再用蒸馏水清洗3次，0.15?
Hgcl清洗20分钟。
之2
后在无菌工作台上打开盛放种子的离心管倒出Hgcl,并用蒸馏水清洗4-5次，再将种2
子倒在灭过菌的滤纸上，吹干（1h）。
接种到不含激素的诱导培养基上28?
避光培
养,30d后将愈伤组织进行继代培养。
然后，7-8天进行一次继代培养。
观察诱导的愈伤，一般长的能自行脱落的样子就可以剥下来进行继代培养。
除去胚乳，
胚芽，将愈伤转入新的N6D，培养。
如果剥下来的愈伤比较大，可以在这一步用镊子
将之剥小。
（注意：
培养基倒平板后在无菌台上吹1小时以上，同时转入的愈伤应在
无菌滤纸上吸干，保证继代时愈伤和培养基间无水膜。
将继代的愈伤重新转一次培养基即可，也应保证培养基吹干和愈伤的干燥。
一般3-4
天就可以用于感染。
（注：
培养基PH5.6）
1.2.1.1大肠杆菌感受态细胞的制备
1．将大肠杆菌DH5α的饱和菌液1ml加入100mlLB液体培养基中，装于用500ml锥形瓶
中，然后于37?
下摇床培养，每过1小时测其OD值，止OD0.421时取出，将菌液立
即置于冰上15分钟。
2．将菌液分装于1.5ml的离心管中，每管1.4ml。
然后于4?
下，4000g/min,离心10
分钟。
3．弃上清，在无菌滤纸上倒置1分钟,使培养基流尽。
溶液重悬细胞。
2
4．向小离心管中加入1ml冰冷的0.1MCacl5．冰浴30分钟。
6．4?
，4000g/min,离心10分钟，弃上清。
7．将离心管倒置于无菌滤纸上1分钟，使Cacl溶液流尽。
8．加入75ul的15?
甘油＋0.1MCacl溶液重悬，然后于-75?
冰箱贮存。
1.2.1.2大肠杆菌转化
1.大肠杆菌DH5α感受态细胞100ul加入5ul待转化质粒，EP管混匀，冰浴30分钟。
2.42?
水浴90秒，然后立即置于冰中2分钟。
3.加入800ulLB培养基，充分混匀。
4.4000r/min,离心18分钟，弃上清。
5.分别加入100ulLB培养基，重悬沉淀。
6.涂布于加抗生素的平板，37?
培养，过夜即见单菌落。
1.2.1.3质粒的微量提取
1.挑取单菌落2ml加入特定选择抗生素的LB液体培养基中,37?
250r/min振荡培养过夜。
2.取含有gfp和PBI121质粒的1.4mL菌液各1.4mL于1.5mLEppendoff管中,12000rpm离心1-2min,弃上清，用滤纸尽量将培养基吸净，干燥10分钟。
3.加入100μLSol?
溶液悬浮细胞,用移液器反复抽吸混匀,室温静置5分钟。
4.加入新鲜配制的Sol?
溶液200μL,上下左右轻缓颠倒离心管将内容物混匀,此时溶液应呈粘稠均匀的液体状,迅速冰浴5-10min。
5.加入冰冷的Sol?
溶液150μL,充分混匀,此时下部溶液应变清亮,并有白色絮状沉
淀浮于上部,迅速冰浴5min。
6.4?
12000rpm离心5分钟,然后小心吸取上清液转入新的1.5mlEP管中。
7.二倍体积的无水乙醇,静置2分钟。
8.4?
12000rpm离心5min,弃上清。
将离心管倒置于滤纸上使液体流出。
9.用1ml70?
乙醇洗涤沉淀，然后弃上清，在空气中使核酸干燥。
10.加30μL的TE缓冲液，其中含有20μL的胰RNA酶溶解DNA，37?
保温30分钟，4?
放置过夜。
1.2.1.4质粒的纯化
质粒GFP和PBI121的纯化是通过PCR清洗试剂盒来纯化的。
1.2.1.5农杆菌EHA105细胞生长状态的测定
取保存的农杆菌EHA105菌株划线接种于LB板（含Rif及Gen），28?
培养36-48小时后挑取单菌落，接种于5ml含Rif和Gen的LB液体培养基中，28?
振荡培养24小时，1：
100转接于新鲜的LB液体培养基中继续培养，每小时测其OD值，并制备感受态细胞。
1.2.1.6根瘤农杆菌EHA105的感受态的制备
1.挑取EHA105单菌落接种于5mLYEB液体培养基中,28?
培养过夜。
2.吸取2mL培养物转入50mLYEB液体培养基,继续振荡培养至OD值约为0.6。
3.将菌液转至1.5ml无菌离心管中,冰浴15min,4?
，4000rpm离心5min,弃上清。
4.分别用800ul20mmol.100mmol.200mmol的冰冷的无菌CaCl重悬沉淀菌体。
2
5.加入无菌甘油,-70?
保存备用。
1.2.1.7根瘤农杆菌EHA105的转化
1.向在100μlEHA105感受态细胞中加入5μL重组质粒DNA,充分混匀。
2.冰浴30分钟,然后转至液氮中冷冻1min.3min.5min.7min.9min，然后立即分
别于28?
.37?
和42?
水浴中温育5min,加入500μlLB液体培养基3.28?
.150r/min预表达培养4小时。
4.然后涂铺含有卡那霉素、利福平LB平板,28?
培育24至48h后即出现单菌落。
1.2.1.8农杆菌质粒DNA的提取
1.挑取菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中,28?
250rpm振荡培养20h.2.取1.5mL菌液于1.5mLEppendoff管中,用微量离心机于4?
5000rpm离心1–2分钟,吸去上清;
3.用STE溶液洗涤菌体两次后弃上清,（用移液枪吹打或用手弹打）使菌液的到充分洗
涤，加入300μL4?
预冷的Sol?
溶液,用移液器反复抽吸混匀,室温静置10min。
溶液600μL,上下轻缓颠倒离心管5-6次,将内容物混匀,此时溶液应呈粘稠均匀的液体状,时温放置10min。
5.加入冰冷的Sol?
溶液450μL,充分混匀,此时下部溶液应变清亮,并有白色絮状沉淀浮于上部,迅速冰浴5分钟。
6.4?
12000rpm离心5-7分钟,小心吸取上清液分别装入3个洁净的1.5mL离心管中（每管610μL）,每管加入0.6v,-20?
冰冷的异丙醇,充分混匀,室温静置10-15分钟。
7.4?
12000rpm离心12-14分钟,弃上清。
8.,加入-20?
冰冷的70%乙醇漂洗沉淀,吹干或抽干近至于透明状;
9.每管用15μLTE溶液溶解沉淀,并将相同类型质粒合并一起待用。
1.2.1.8农杆菌质粒DNA的验证
经酶切于7%凝胶电泳。
1.2.1.9农杆菌的培养
将适量的农杆菌（100ul）涂布接种于LB培养基上，EHA105暗培养36小时即可。
（抗生素kana50mg/L。
）
1.2.2.1感染和共培养
1.悬浮：
50ml离心管加入30ml1/2N6D。
取灭菌小勺划取农杆菌，用勺背将菌体贴在
管壁轻轻拍散，OD=0.8-1.0。
2.感染：
将前培养的愈伤集中到另一个平皿，一次性转入菌液中，轻轻转动，使菌
液均匀分布，静置15-20分钟。
3.共培养：
将菌液倒出，愈伤在无菌滤纸上放2小时以上，保证菌液吸干，接至1/2N6D
培养基上，20?
，1.5-2d,看到愈伤与培养基接触部分有菌膜，就可以除菌。
1.2.2.2农杆菌的去除
1.将共培养的愈伤装入50ml离心管，用无菌水清洗3次以上至液体比较清亮。
2.倒出无菌水，N6D+Cn500mg/L,100rpm,15-20分钟，2-3次。
3.将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2小时以上。
1.2.2.3愈伤组织的筛选
1.将干燥的愈伤转入N6DS中，第一次选择不加Hn，加Cn，28?
，7-10天。
2.挑出没被农杆菌污染的愈伤，第二次加Cn和Hn（50mg/L），15-20天。
如果这次选择
中，仍有愈伤污染，挑出好的再转平板选择一次。
3.第三次同上，不加Cn，加Hn,把所有的愈伤全部转接一次，15-20天。
4.第四次选出新的愈伤用Hn筛选，15-20天。
5.次数不必依上序，但是应保证愈伤在Hn上筛选的时间至少45天以上，第四次挑出
的新长出的愈伤最好筛选20天。
6.N6DS:
N6D+Cn250mg/L+Hn50mg/L,PH5.8-5.9
1.2.2.4愈伤的分化
1.将第四次筛选的全部愈伤组织移入MS中，Hn50mg/L,暗培养，预分化12-15天。
2.选出长势好的新的愈伤（淡黄色），移入MS，光培养15-20天，可看到绿芽长出，
一般15天换一次培养基。
1.2.2.5GUS染色和荧光观察
1.取转化的愈伤组织浸泡于GUS染色液中,在37?
下反应12～16h,弃去染色液,用
体积分数95%的酒精75?
下脱色,在解剖显微镜下观察。
染色液组成为50mmol/L
的磷酸钠缓冲液（pH7.0）,10mmol/LEDTA,体积分数0.1%，TritonX-100,1mmol/L
X-Gluc,0.1mmol/L铁氰化钾,0.1mmol/L亚铁氰化钾,体积分数20%甲醇。
2.在20倍物镜下检测筛选多代的抗性愈伤组织酶解得到的单细胞或细胞团的绿色荧
光，同时设置相同处理的未转基因材料对照。
以PCR证明含有gfp基因的再生植株
为对象，将再生苗的各部分器官分别放在载玻片上，滴加10?
的甘油，盖玻片压
片，同时设置相同处理的未转基因材料对照，10倍物镜下检测。
取新鲜的转接后培养不同时间的农杆菌感受态细胞（TSS缓冲液重悬），其他转化条件均一致，结果OD
值在0.1-1.4之间各生长时期的细胞，以OD值约0.6时效率600600最高，如图1所示。
实验中，分别用20mmol/L，100mmol/L，200mmol/L的Cacl2溶液重悬细胞，在其他转化条件均一致的情况下，测定农杆菌的转化效率，结果以20mmol/LCacl2作为重悬液制备的感受态细胞转化效率最高。
（图2）
图1.农杆菌细胞生长状态对转化率的影图1.农杆菌细胞生长状态对转化率的影响响
200200PBI121转gfp转化率化率28?
（10×
）（1037?
28?
0×
）0.290.580.9837?
0OD600值0.290.580.98
OD600值
图2Cacl2浓度对转化率的影响图2Cacl2浓度对转化率的影响1015810628?
4537?
37?
2（100×
）00PBI121转化率2010020020100200gfp转化率（100×
）Cacl2浓度（mmol/L）Cacl2浓度（mmol/L）
图3冷冻时间对转化率的影响图4融化温度对gfp转化率的影响8866转化率4折线图1（100×
420mM2）2100mM0200mM转化率（100×
）01357928?
冷冻时间（min）温度（?
）
图4融化温度对PBI121转化率的影响
1210转化率8（100×
620mM4）100mM2200mM028?
温度（?
速冻时间可能对转化效率有影响。
实验中首先用TSS缓冲液或Cacl2溶液重悬细
胞，于液氮中速冻1分钟.3分钟.5分钟.7分钟.9分钟后，在其他转化条件均一致的情况下，测定了农杆菌的转化效率。
结果表明，Cacl2溶液重悬的感受态细胞在液氮中速冻5分钟的转化效率最高（图3）。
以上实验中，为了进一步提高转化效率，同时检验不同的热处理对农杆菌转化效
率的影响，以Cacl2重悬细胞，液氮速冻5分钟后，分别用28?
，37?
水浴处理5分钟。
测定的结果表明，在农杆菌的最适生长温度28?
融化，获得的转化效率最高，约1.2×
10?
，结果如图4。
取部分共培养后的愈伤组织进行GUS的瞬时表达检测，大部分都能染色，没有经
转化处理的对照无任何蓝色反应。
对经过多代筛选的愈伤组织进行GUS的稳定表达的检测，发现90?
愈伤组织表现蓝色。
表明T-DNA已经稳定整合到水稻基因组中,为有
效分离水稻的基因启动子元件和基因调控序列打下基础。
未转化细胞发出黄色荧光，而转化细胞发出较强的绿色荧光。
未转基因叶片由于
叶绿素的存在，呈现红色背景，未见有自发绿色荧光，但由于叶片表面绒毛的存在，
出现有规则的黄色荧光，而转基因叶片上则有自发绿色荧光的存在。
虽然发光强度有
所不同，但约80?
的植株都发出可检测的绿色荧光。
发光部位有较大差别，所有植株
的叶和茎都发出绿色荧光。
为了提高农杆菌的转化效率，探索一种简便易行的方案，本研究在冻融法的基础
上，结合Cacl2法和TSS法，对农杆菌转化的各步骤进行了改进和优化，在本实验的最
优条件下，转化效率可达10
4。
在制备感受态细胞时，保证一定的菌液浓度是获得高转化率的前提，但不是越弄
越好。
根据实验中测得的生长曲线表明，在细菌生长的对数期，菌浓度在OD600值约
0.6时制备的感受态细胞转化率最高。
为了提高细菌细胞的感受性，用Ca?
和Mg?
处理细胞，结果均获得了较高的转化
效率，其中用20mmol/L制得的感受态细胞转化率最高。
与经典的冻融法不同，本实验中使用28?
，其转化效率比37?
的高数倍。
推测高于农杆菌正常生长温度时，虽然抑制了细胞内的各种酶活性，但由于温度过高对细胞产生
较大损伤，反而使细胞的存活性大为降低。
植物遗传转化是应用重组DNA.细胞组织培养或种质系统转化等技术，将外源基因
导入植物细胞或组织，使之整合。
表达和遗传来修饰植物原有遗传物质而改良作物不
育农艺，提高产量.品质和抗逆性等。
所以建立一个高效的遗传转化体系是获得转基
因植物的先决条件之一。
GUS报告基因插入到水稻基因报告基因可以确定转化体与非转化体,并且检测外源基因在受体内的表达情况。
增强子附近时,基因才能够表达,从而捕获到水稻增强子。
由于增强子可以在其GUS本试验所用载体为增强子捕获载体,即当弱启动子的
作用距离范围内的任何方向增强GUS基因表达,因而捕获效率高。
绿色荧光蛋白的运用给活体检测农杆菌接种的植物组织提供了可能，使得我们能够准确定位转化外植体
上的转化细胞或分化的转化愈伤组织
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