一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究讲解.docx

一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究讲解.docx

《一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究讲解.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究讲解.docx（17页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究讲解

农业环境科学学报２００８，２７（３）：

１１４６－１１５０

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｏ－ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ

一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究

王成林１，２，周巧红１，王亚芬１，２，梁

威１，吴振斌１

（１．中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉４３００７２；２．中国科学院研究生院，北京１０００３９）

摘要：

从复合垂直流人工湿地表层基质中分离出一株硝化活性较强的异养硝化细菌Ｈ－１，进行ｂｉｏｌｏｇ菌种鉴定，鉴定系统中没有

与该菌株特性相似的数据记录。

１６ＳｒＤＮＡ的序列分析结果显示，菌株Ｈ－１与产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）粪产碱杆菌（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）有９８％相似性，认为分离菌株Ｈ－１可能为ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ。

通过４因素３水平的正交试验，结果显示，当温度为３０℃，ｐＨ为７．５，接种量为１０７ＣＦＵ，溶氧２．２５ｍｇ・Ｌ－１时，该菌株亚硝化反应效果最佳；影响亚硝化反应效果的因素顺序为：

溶氧＞温度＞ｐＨ＞接种量；温度和溶氧影响极显著，ｐＨ和接种量影响相对不显著。

关键词：

人工湿地；异养硝化细菌；１６ＳｒＤＮＡ；正交试验中图分类号：

Ｘ１７２

文献标识码：

Ａ

文章编号：

１６７２－２０４３（２００８）０３－１１４６－０５

ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＮｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＨｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃＮｉｔｒｉｆｉｅｒＢａｃｔｅｒｉａｌＳｔｒａｉｎ

ＷＡＮＧＣｈｅｎｇ－ｌｉｎ１，２，ＺＨＯＵＱｉａｏ－ｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧＹａ－ｆｅｎ１，２，ＬＩＡＮＧＷｅｉ１，ＷＵＺｈｅｎ－ｂｉｎ１

（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００７２，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：

Ａｓｔｒａｉｎｏｆｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｆｉｅｒ，ｎａｍｅｄＨ－１，ｗｈｉｃｈｈａｄｈｉｇｈｅｒｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｌａｙｅｒｓｏｆｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｖｅｒｔｉｃａｌｆｌｏｗｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｅｔｌａｎｄ．ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆＢｉｏｌｏｇＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｍｉｌａｒｒｅｃｏｒｄｓａｓｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｉｎｔｈｅｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎ１６ＳｒＤＮＡｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｗａｓ９８％ｈｏｍｏｌｏｇｙａｔｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｅｖｅｌｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ１６ＳｒＤＮＡｏｆＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ．ＩｔｗａｓｔｈｏｕｇｈｔｔｈａｔｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎＨ－１ｗａｓｐｏｓ－ｓｉｂｌｙＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｆｏｕｒｆａｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｏｕｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｎｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｎｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｗａｓｏｐｔｉｍａｌｗｈｅｎｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｉｅｓａｎｄ

・Ｌ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｌｙ．ＳｏｒｔｉｎｇＯｒｄｅｒｏｆｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｏｎｔｈｅｎｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｗａｓｄｉｓｓｏｌｖｅｄｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｗｅｒｅ３０℃，７．５，１０７ＣＦＵａｎｄ２．２５ｍｇ

ｏｘｙｇｅｎ＞ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＞ｐＨ＞ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ；Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｏｎｎｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ，ｂｕｔｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｐＨａｎｄｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｎｎｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｗｅｒｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｅｔｌａｎｄ；ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｆｉｅｒ；１６ＳｒＤＮＡ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ

废水生物脱氮是目前水处理领域关注和研究的热点。

关于异养硝化作用，虽然目前仍有很多机理未得到解释，对一些现象的解释也不尽圆满，但异养硝化作用的重要性日益受到关注［１￣４］。

相对于自养硝化菌而言，异养硝化细菌的分解效率较低，但是由于它们在环境中的数量以及生长速率上往往远大于自养菌，

收稿日期：

２００７－０９－１８

基金项目：

国家“十五”科技项目（２００２ＡＡ６０１０２１）；国家杰出青年基金

项目（３９９２５００７）；湖北省科技攻关重大项目（２００６ＡＡ３０５

因此在某些环境之中，异养硝化细菌作用的贡献可以与自养菌相当。

在人工湿地系统中，微生物的硝化、反硝化作用在氮的去除中有重要作用［５］，根据Ｏｏｓｔ－

ｒｏｍ报道人工湿地系统对氮的去除，从贡献上看依次

为：

微生物降解＞基质吸附＞植物的吸收［６］。

硝化作用是指将ＮＨ３－Ｎ氧化为ＮＯｘ－－Ｎ的生物化学反应，包括

亚硝化反应和硝化反应两个步骤。

本试验拟从人工湿地系统中分离能进行异养硝化反应的菌株，并通过正交试验试图找出影响亚硝化反应效果的主要因素和最佳条件，从微生物角度来说，丰富了高效菌种库，为提高湿地处理效率和强化湿地的功能提供技术支持，

Ａ０３）

作者简介：

王成林（１９７９—），男，湖北浠水人，硕士研究生，研究方向为

环境微生物。

Ｅ－ｍａｉｌ：

ｗｃｌｈｚｎｙｄｘ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ

通讯作者：

吴振斌

Ｅ－ｍａｉｌ：

ｗｕｚｂ＠ｉｈｂ．ａｃ．ｃｎ

第２７卷第３期农业环境科学学报１１４７

并为湿地人工强化技术提供了理论依据。

１材料和方法

１．１采样位点

取自中国科学院水生生物研究所复合垂直流人工湿地系统表层基质，采样方法采用梅花布点法，样品混合后立即置于４℃下保存。

ＡＧＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ；１４９２ｒ：

ＣＧＧＣＴＡＣＴＴＧＴ

Ｌ，其中包括ＴＡＣＧＡＣＴＴＣ。

ＰＣＲ反应体系为２５μ

０．５μＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ・Ｌ－１），正反向引物各０．５μＬ

（２．５μ・缓冲液，ＭｇＣｌ２１．５μｍｏｌＬ－１），２．５μＬ１０×Ｌ（２５ｍ・・ｍｏｌＬ－１），０．５μＬＴａｑ聚合酶（２ＵμＬ－１），１８μＬ无菌去

离子水，２μＬＤＮＡ；各成分充分混合后，进行如下反应：

９４℃预变性５ｍｉｎ，再进行４０个循环，９４℃变性３０ｓ，５０℃复性３０ｓ，７２℃延伸１２０ｓ，最后７２℃延伸

１．２异养硝化细菌的分离筛选１．２．１选择性培养基组成

乙酰胺２ｇ，ＮａＯＨ１．６ｇ，ＫＨ２ＰＯ４８．２ｇ，ＭｇＳＯ４・

１０ｍｉｎ。

ＰＣＲ产物用１％琼脂糖进行电泳，ＥＢ染色，扫

描成像。

结果分析：

ＤＮＡ序列同源性分析在ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）网站参（ｈｔｔｐ：

／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）采用Ｂｌａｓｔ软件检索。

考序列取自Ｇｅｎｂａｎｋ，ＥＭＢＬ（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ

７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ＫＣｌ０．５ｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．５ｍｇ，ＣａＳＯ４・

・・２Ｈ２Ｏ０．５ｍｇ，ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｍｇ，ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ０．５ｍｇ，

用蒸馏水定容至１Ｌ，ｐＨ７．０。

１．２．２富集培养

取基质样品１０ｇ于盛有２５０ｍＬ灭菌选择性培养液的锥形瓶中，在恒温震荡培养箱中富集培养７ｄ，・温度设置为３０℃，转速１００ｒｍｉｎ－１。

ＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ），ＤＤＢＪ（ＤＮＡＤａｔａＢａｎｋｏｆＪａｐａｎ）等

数据库。

并将搜寻到的同源序列用ＣｌｕｓｔａｌＸ［８］软件进

行序列排序，然后用Ｍｅｇａ３．１［９］软件进行系统进化树构建和分析。

１．２．３细菌的分离与纯化

吸取富集培养液１０ｍＬ加入到盛有１００ｍＬ无菌蒸馏水的２５０ｍＬ锥形瓶中，于恒温振荡器上以１００ｒ・ｍｉｎ－１转速，在３０℃下振荡４ｈ，进行稀释涂布，于

进行３次纯化与分离。

形成生化培养箱３０℃下培养。

单菌落后，依据不同的形态、质地、边缘、光学特性和颜色，初选出２１株纯菌株，斜面保存，用于进一步硝化活性检验。

１．４异养硝化细菌硝化效果的正交试验设计

１．４．１样品的配备

挑取一接种环Ｈ－１细菌菌苔于上述液体培养基中扩大培养７ｄ，在无菌条件下取１００ｍＬ处于对数生

・长期的实验菌液以３０００ｒｍｉｎ－１的转速离心８ｍｉｎ，去

除上清液，用无菌水冲洗后再离心，重复３次，最后用无菌水配成５ｍＬ的菌悬液用于试验定量接种备用。

１．４．２正交试验营养溶液配方

为了研究纯化菌株在好氧条件下的亚硝化作用效果，进行亚硝态氮监测，实验中应用培养基的具体配比见表１。

１．２．４硝化活性验证

将斜面上生长的菌苔用接种环挑取适量接种用于硝化活性鉴定［７］，将具有硝化活性的细菌用石蜡液封保藏备用。

１．４．３控制因素选择

本试验为了研究异养硝化细菌亚硝化作用效果，设计Ｌ９（３４）正交试验，共４因素：

温度、接种量和ｐＨ、溶解氧，分别编号为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，取３个水平：

温度（Ｔ）取

１．３菌种鉴定

１．３．１ｂｉｏｌｏｇ分析

采用美国产ｂｉｏｌｏｇ微生物全自动分析仪，挑选一株硝化活性较强的细菌Ｈ－１进行ｂｉｏｌｏｇ菌种鉴定。

１．３．２１６ＳｒＤＮＡ序列分析

用ＣＴＡＢ方法提取该细菌Ｈ－１的ＤＮＡ，并进行ＰＣＲ扩增。

细菌通用引物２７ｆ－１４９２ｒ序列：

２７ｆ：

２０℃、２５℃、３０℃，ｐＨ取４．５、７．５、８．０，接种量取１０７ＣＦＵ，

・１０８ＣＦＵ，１０９ＣＦＵ，溶氧（ＤＯ）１．１６、２．２５、３．７６ｍｇＬ－１。

１．４．４试验装置和监测方法

试验主体装置为３个可控温摇床，１０个５００ｍＬ

表１营养溶液成分配比列表

Ｔａｂｌｅ１ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｉｎｔｈｅｂａｔｃｈｔｅｓｔ

１１４８王成林等：

一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究

２００８年５月

锥形瓶，编号０￣９，０为空白样品，用于亚硝化效果测定的营养溶液配方见表１，营养溶液在接种前为无菌。

按照正交试验设计方案要求，将９个样品分到３个可控温摇床中培养２０ｄ，ＮＯ２－－Ｎ标按国家标准方法进行测定［１０］，亚硝化反应速率为单位时间ＮＯ２－－Ｎ浓度的改变。

ｃａｌｉｇｅｎｅｓ）有下列菌种：

粪产碱杆菌（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；皮氏

产碱杆菌（Ａ．ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ）；木糖氧化产碱杆菌脱硝亚种

（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）；木糖氧化产碱杆

菌木糖氧化亚种（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）；真养产碱杆菌（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）；广泛产碱杆菌（Ａ．ｌａｔｕｓ）；从１６ＳｒＤＮＡ基因序列分争论产碱杆菌（Ａ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）。

析结果来看，作者从人工湿地中分离的一株异养硝化细菌Ｈ－１属于产碱杆菌属，一般认为凡是１６ＳｒＤＮＡ序列同源性大于９７％的两株细菌即可确定为同一种，在本试验中测试的株菌Ｈ－１与粪产碱菌１６ＳｒＲＮＡ序列同源性大于９７％，所以认为从人工湿地中分离的一株异养硝化细菌Ｈ－１属于产碱杆菌属粪产碱菌种。

２结果与讨论

２．１菌株分离与ｂｉｏｌｏｇ微生物全自动分析仪鉴定结

果

从２１株纯化菌株中检验出两株具有硝化活性的异养硝化菌，编号为Ｈ－１、Ｈ－２，通过硝化活检验中的显色反应，发现Ｈ－１活性较强。

ｂｉｏｌｏｇ微生物全自动分析仪结果显示Ｂｉｏｌｏｇ微生物鉴定系统中没有与菌株Ｈ－１特性相似的数据记录。

作者将ＧＮ２碳源利用情况建立指纹档案，进一步用分子手段进行分析以期找出更多该菌种的信息。

２．３正交试验结果分析

２．３．１温度的影响

从图２可看出，在亚硝化反应中，２５℃是该菌株亚硝化速率趋势改变的分界点，当温度在３０℃时，亚硝化效果达到最佳。

符合Ｈｕｌｔｍａｎ［１２］提出硝化细菌的生长速率Ｕ和温度之间的关系，Ｕ＝（Ｕｎ，２０）［１００．０３（Ｔ－２０）］

２．２１６ＳｒＤＮＡ基因序列分析

经ＮＣＢＩＢｌａｓｔ检索，所筛选菌株Ｈ－１和Ａｌｃａｌｉ－ｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ（ＤＱ１１０８８２）有９８％的同源性，因此作者初步认为本研究分离得到的一株异养硝化细菌Ｈ－１

属于产碱杆菌属粪产碱菌种，又选择了多种产碱杆菌属的１６ＳｒＤＮＡ全序列：

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ（Ｄ８８００７），

ｄ－１大多数硝化细菌的合适生长温度在２５￣３０℃之间，低于２５℃或高于３０℃硝化细菌生长和硝化作用

减慢。

因此温度对硝化细菌生长和亚硝化反应速率有很大影响。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ（ＡＢ０１０８４１），Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓａｑｕａｔｉｌｉｓ

（ＡＪ９３７８８９），Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ（Ｙ１４９０８）进行系统分析（见图１），结果也显示该菌株和产碱杆菌属粪产碱杆菌显示出更高的同源性。

Ａｎｄｅｒｓｏｎ等［１１］报道粪

产碱杆菌为异养硝化细菌，该菌在低碳条件下进行硝化作用，也可以在有机环境中进行硝化作用。

根据伯杰鉴定细菌学手册介绍，产碱杆菌属（Ａｌ－

２．３．２ｐＨ的影响

从图２可看出，在亚硝化反应中，随着ｐＨ升高，亚硝化速率先升后降，当ｐＨ＝７．５时，亚硝化反应效果达到最佳。

ｐＨ是影响亚硝化作用重要环境因素之一，在ｐＨ中性或微碱性下，亚硝化反应过程迅速，若ｐＨ进一步升高，从ＮＨ４－←→ＮＨ３平衡关系中知道，ＮＨ３浓度会迅速提高［１４］。

由于硝化菌对氨很敏感，从而会

Ｓ１

１００１００

ＡｌｃａｌｉｎｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓＡｌｃａｌｉｎｇｅｎｅｓａｑｕａｔｉｌｉｓＡｌｃａｌｉｎｇｅｎｅｓｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ

１００

ＡｌｃａｌｉｎｇｅｎｅｓｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓＡｌｃａｌｉｎｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ

０．０７０．０６０．０５０．０４０．０３０．０２０．０１０．００

图１基于１６ＳｒＤＮＡ构建的系统发育树

Ｆｉｇｕｒｅ１Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｃｅｄｏｎ１６ＳｒＤＮＡ

第２７卷第３期

亚硝化反应速率／ｍｇ・・Ｌ－１ｄ－１０．００１

农业环境科学学报１１４９

１．４１．２１．００．８０．６０．４０．２０

Ａ１Ａ２Ａ３

Ｂ１Ｂ２Ｂ３

Ｃ１Ｃ２Ｃ３

Ｄ１Ｄ２Ｄ３

在１．５￣２．０ｍｇ・・Ｌ－１，低于０．５ｍｇＬ－１，则硝化作用趋于停止，在ＤＯ远远大于２．０ｍｇ・Ｌ－１时，溶解氧浓度对亚硝化反应的影响不予考虑。

从图２可看出，溶解氧水平的变化对亚硝化反应速率的影响较大。

２．３．５亚硝化作用效果分析

由表２最优组合结果可看出：

当温度为３０℃，ｐＨ为７．５，接种量为１０７ＣＦＵ，溶氧２．２５ｍｇ・Ｌ－１时，亚硝化反应效果最佳。

Ｋｕｅｎｅｎ［１４］在他的研究基础上总结出了异养硝化菌在进行硝化作用时的代谢通式，包括无机氮硝化代谢途径（即ＮＨ４＋→ＮＨ２ＯＨ→ＮＯ２－→ＮＯ３－）和有机氮硝化代谢途径（即ＲＮＨ２→ＲＮＨＯＨ→Ｒ－ＮＯ→

因素水平

图２亚硝化反应速率在４因素３水平条件下变化趋势图

Ｆｉｇｕｒｅ２Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆｎｉｔｒｏｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗｉｔｈ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓ

影响到亚硝化作用速率。

ＲＮＯ２→ＮＯ３），本试验异养硝化菌在进行硝化作用时

的代谢通式是ＮＨ４＋→ＮＨ２ＯＨ→ＮＯ２－→ＮＯ３－，其中

２．３．３接种量的影响

从图２可看出，在亚硝化反应过程中，随着接种

量增加，亚硝化反应速率降低，硝化细菌繁殖的速率极大地受到营养条件和所处环境的影响，基数大，营养条件不同，不一定繁殖速度快。

本试验接种量较小时，亚硝化速率较大，接种量较大时，亚硝化速率较小，可能接种量刚好处在营养竞争限制的范围内。

接种量小反而利于异养硝化细菌生长，接种量大，由于营养竞争，不利于异养硝化细菌生长。

ＮＨ４＋→ＮＨ２ＯＨ→ＮＯ２－途径反映了亚硝化作用，无机

态氮的形态转化由异养硝化菌在进行硝化作用时的代谢情况决定。

研究湿地菌株亚硝化反应效果最佳条件，进一步探索如何提高全程硝化反应效率，将对如何人为控制人工湿地运行条件及提高人工湿地高氨氮废水去除效果提供参考和理论依据。

由表２、表３可看出：

亚硝化反应中，溶氧对亚硝化反应效果影响最大，其次是温度和ｐＨ，而接种量影响较小，温度和溶氧影响高度显著，ｐＨ和接种量不显著。

一般的潜流湿地，污水主要经过厌氧环境，在处理氨氮含量高的污水时往往因为硝化作用不足，不能将氨氮充分转化为反硝化作用的原料硝酸盐氮和亚硝酸盐氮，从而限制了湿地的除氮能力［１５］。

复合垂直流人工湿地的结构以及下行流至上行流的水流方式，形成了基质床内好氧－厌氧的溶解氧状态变化，从而保证了硝化作用－反硝化作用的充分进行，利于污水的高效脱氮，湿地的表层微生物具有较强的硝化作用，也是硝化作用作为氮素主要作用途径的基质［１６］。

由影

２．３．４溶解氧的影响

从图２可看出，在亚硝化反应中，随着ＤＯ升高，

・亚硝化反应速率先升后降，当溶解氧为２．２５ｍｇＬ－１

时，亚硝化反应效果达到最佳。

硝化细菌为了获得足够的能量用于生长，必需氧化大量的ＮＨ４＋和ＮＯ２－，环境中的溶解氧浓度大小会极大地影响亚硝化反应速度和硝化细菌的生长速率，溶解氧浓度与硝化细菌生长速率公式［１３］为Ｕｎ＝（Ｕｎｍａｘ）（ＤＯ／ＤＯ＋Ｋ０），从公式可知，当ＤＯ增大时，硝化细菌生长速率增大，当环境

ＤＯ!

Ｋ０时，Ｕｎ＝Ｕｎｍａｘ。

大多数学者认为溶氧应控制

表３试验结果方差分析

Ｔａｂｌｅ３ＴｈｅＶａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ

注：

＊＊表示极显著，＊表示相对不显著。

１１５０王成林等：

一株异养硝化细菌的分离鉴定及其亚硝化作用研究

境科学，２００３，２４１（１）：

８０－８３．

２００８年５月

响因素排序和显著性可知，溶氧和温度对亚硝化反应的影响最大，提高湿地表层溶解氧和控制合适的温度，能够提高湿地的硝化效率和处理高含量氨氮污水的能力。

因此为了提高氨氮的去除率，可以考虑把主要影响因素选出，控制好条件，忽略次要影响因素，从而在强化人工湿地功能的条件选择上提供指导，避免造成浪费。

ＬＩＵＣｈａｏ－ｘｉａｎｇ，ＤＯＮＧＣｈｕｎ－ｈｏｎｇ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｎｉｔｒｉｆｉｃａ－ｔｉｏｎｉｎａｓｕｂｓｕｒｆａｃｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｅｔｌａｎｄｓｙｓｔｅｍｔｒｅａｔｉｎｇｓｅｗａｇｅ［Ｊ］．Ｅｎ－ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２００３，２４１（１）：

８０－８３．

［６］ＪｖａｎＯｏｓｔｒｏ．Ｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｍｏｖａｌｉｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｅｔｌａｎｄｓｔｒｅａｔｉｎｇｎｉｔｒｉｆｉｅｄｍｅａｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｅｆｆｌｕｅｎｔ［Ｊ］．ＷａｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９５，３（３２）：

１３７－１４７．

［７］中国科学院南京土壤研究所微生物室编著．土壤微生物研究方

法［Ｍ］．科学出版社出版，１９８５．

３结论

（１）用传统微生物方法从复合垂直流人工湿地中分离筛选出一株硝化活性较强的异养细菌Ｈ－１，进行

ＮａｎＪｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｓｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｏｋ－ｍａｋｉｎｇ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅ［Ｍ］．Ｓｃｉｅｎｃｅｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇｃｏｍｐａｎｙ，１９８５．

［８］ＴｈｏｍｐｓｏｎＪＤ，ＧｉｂｓｏｎＴＪ，ＰｌｅｗｎｉａｋＦ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＣｌｕｓｔａｌＸｗｉｎｄｏｗｓｉｎ－ｔｅｒｆａｃｅ：

４８８２．

［９］ＫｕｍａｒＳ，ＴａｍｕｒａＫ，ＮｅｉＭ．ＭＥＧＡ３：

Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ［Ｊ］．ＢｒｉｅｆｉｎｇｓｉｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，５：

１５０－１６３．

编委会，水和废水检测分析方法（第三［１０］《水和废水监测分析方法》

版）［Ｍ］．北京：

中国环境科学出版社，１９９７．

ｂｉｏｌｏｇ菌种鉴定，鉴定系统中没有与该菌株特性相似

的数据记录，可能该菌株信息不在鉴定系统数据库中，进一步采用分子方法，１６ＳｒＤＮＡ扩增，经ＮＣＢＩ

ｆｌｅｘｉｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｉｄｅｄｂｙ

ｑｕａｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２４（６）：

４８７６－

Ｂｌａｓｔ检索，该菌株和Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ（ＤＱ１１０８８２）

有９８％的同源性，因此作者初步认为本研究分离得到的一株异养硝化细菌Ｈ－１属于产碱杆菌属粪产碱

菌种。

（２）通过正交试验结果显示当温度为３０℃，ｐＨ为７．５，接种量为１０ＣＦＵ，溶氧２．２５ｍｇ・Ｌ时，亚硝

７

－１

ＷａｔｅｒａｎｄＷａｓｔｅＷａｔｅｒＭｏｎｉｔｏｒＡｎａｌｙｓｉｓＭｅｔｈｏｄ（Ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ）［Ｍ］．ＣｈｉｎｅｓｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇｃｏｍｐａｎｙＩｎＢｅｉｊｉｎ．１９９７．［１１］ＡｎｄｅｒｓｏｎＩＣ，ＰｏｔｈＭ，ＨｏｍｓｔｅａｄＪ，ｅｔａｌ．ＤＡｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＮＯａｎｄＮ２Ｏ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｆｉｅｒＮｉｔｏｒｓｏｍｏｎａｓｅｕｒｏｐａｅａａｎｄｔｈｅｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｆｉｅｒＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３，５９（１１）：

３５２５－３５３３．

［１２］李沛霖，李大平，何晓红．生物膜处理无机氨氮废水及其好氧反硝

化现象［Ｊ］．水处理技术，２００７，２（１）：

７８－８１．

化反应效果最佳；亚硝化反应中，溶氧对亚硝化反应效果影响最大，其次是温度和ｐＨ，而接种量影响较小，温度和溶氧影响高度显著，ｐＨ和接种量影响相对不显著。

因此将影响异养硝化细菌代谢的因素控制在一定值，可以达到最佳亚硝化效果，控制好主要影响因素和条件，可以提高湿地的硝化效率和降低运行成本。

参考文献：

［１］ＢｒｉｅｒｌｅｙＥＤＲ，ＷｏｏｄＭ．Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎａｎａｃｉｄｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌ：

ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆａｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００１，３３：

１４０３－１４０９．

［２］ＬｉｎＹ，ＫｏｎｇＨＮ，ＨｅＹＬ，ｅｔａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｎｉｔｒｉ－ｆｉｃａｔｉｏｎｉｎａｍｅｍｂｒａｎｅｂｉｏｒｅａｃｔｏｒａｎｄｉｓｏｌａｔｉ