微生物种群的鉴定方法选择.docx
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微生物种群的鉴定方法选择
目前用于湿地微生物群落结构分析的技术主要有平板计数法、荧光染色法、Biolog微平板分析、微生物醌指纹法、磷脂脂肪酸（PLFA）谱图、荧光原位杂交（FISH）技术等。
近年来，变性梯度凝胶电泳、随机扩增多态性DNA标记、单链
构象多态性等方法在湿地研究中也开始应用，对湿地中微生物的研究起到显著的推动作用。
以期为利用现代分子技术研究人工湿地中微生物种群净化机理提供参考。
1PCR-DGGE（PolymeraseChainReac-tionandDenaturingGradientGelElectro-phoresis）
1.1DGGE原理
DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的,主要是用于检测DNA突变的一种电泳技术。
1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域。
DGGE利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA分开。
与其它电泳系统相比，它不是基于核酸分子量的不同将DNA片段分开，而是根据序列的不同将片段大小相同的DNA序列分开。
当双链DNA分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其解链的速度和程度与其序列密切相关，相同碱基对数目的双链DNA分子由于碱基对组成的不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时,即开始部分解链，解链程度越大，迁移阻力大，DNA分子的迁移速度随
之减小，产生的迁移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱。
理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低可检测到只有1个碱基差异的DNA片段。
1.2PCR-DGGE在人工湿地研究中的应用
1.2.1微生物数量、丰度及多样性
Dong等用PCR-DGGE技术鉴别分析用来处理猪圈废水的湿地基质中微生物的情况，得出菌种的分布与总磷、硝酸盐、磷酸盐的浓度显著相关，从进水到出水中微生物的多样性及丰度显著降低，其优势种为Pseudomonassp.（假单胞菌）,
Arthrobac-tersp.（节细菌属）,Bacillussp.（杆状菌）。
通过系统发育分析表明一部分16SrRNA的基因序列与不可培植的反硝化细菌具有极大的相关性，而这些反硝化细菌的活动对湿地中氮的去除起着重要的作用。
Yin等利用DGGE技术分析处理受污染景观湖水的三个水平潜流湿地中微生物的多样性、总的微生物群落的改变以及氨氧化细菌的组成。
通过PCR对携带单加氧酶的基因序列进行扩增，得出季节的变化对微生物群落的多样性和组成具有影响；序列分析说明湿地中氨氧化细菌是不可培养的，其菌群中含有大量的亚硝化单胞菌类似序列。
Guo等利用PCR-DGGE技术分析人工湿地处理二级废水后混合水中的微生物群落的结构，得出微生物菌群的多样性。
Gorra等利用PCR-DGGE技术鉴别处理污水的湿地基质对氨氧化细菌群落多样性和稳定性的影响，结果表明不同基质上群落的组成没有很大的区别，其中沸石最有利于氨氧化细菌的活动。
1.2.2特定微生物功能群
Drewe等通过嵌套的PCR对芦苇湿地进出水、基质及植物根区等15个位点上的Mycobacteriumavium（鸟分支杆菌）进行监测，得出芦苇湿地对鸟分支杆菌具有良好的去除作用，因而对鸟类肺结核具有有效的控制作用。
Park等（2009）通过利用实时PCR技术鉴别和定量测定分别种植菖蒲、黄睡莲、香蒲的表面流人工湿地中脱氮菌和除硫菌的活动状况。
Ruiz-Rueda等通过PCR-DGGE技术鉴别了湿地中阔叶香蒲和芦苇根际的硝化反硝化菌的活动及其群落结构，并判断它与湿地中的植物种类的相关性。
Huang等应用
PCR-DGGE技术调查处理富营养观赏水的复合垂直流人工湿地中氨氧化细菌的多样性及活动分布的空间变更，并测定氨氧化细菌在湿地的不同层对富营养水的净化。
Sundberg等将氨氧化和反硝化菌群分别用目标16SrDNA基因探针和功能基因nosZ进行PCR扩增，结果由DGGE及核苷酸序列分析，以检测用来处理高氮浓度的垃圾掩埋浸析液的人工湿地中硝化和反硝化作用及其相应的菌群。
2LH-PCR（LengthHeterogeneityPCR）
LH-PCR是于1998年在国外发展起来的一项新技术。
在LH-PCR中，荧光标记探针被用来决定来源于不同微生物扩增序列的相对数量，带标记的片段在电泳胶上被分离出来，而后被一个带有荧光性激光的自动基因顺序分析仪所监测到。
Nancy等（2000）利用LH-PCR技术评估土壤微生物群的组成，并发现LH-PCR的结果具有可重复性。
Ahn等利用LH-PCR在不同湿地植物和磷负荷下采集人工湿地基质中微生物的指纹，通过对群落菌群克隆和排序来确定其微生物的多样性；并应用主坐标分析及相似性分析得出高磷负荷会使基质微生物群落结构发生显著改变且能降低其多样性，克隆排序表明不同的磷含量产生不同的微生物群落。
3T-RFLP（Terminal-RestrictionFrag-mentLengthPolymorphism）
T-RFLP（末端限制性酶切片段长度多态性）分析是在PCR技术和RFLP技
术基础上发展起来的微生物群落分析技术，所不同的是在PCR扩增16SrRNA基
因的过程中，其中一个引物用荧光标记，在计算机程序自动分析时仅分析带荧光标记的末端限制片段，这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化，且每个可见的条带都代表一个“核型”或一个分类单元。
相对于其它分子生物学分析技术如RFLP、DGGE等，它具有分辨率高、易于实现自动化等特点。
Nicorarat等利用T-RFLP技术对处理酸化煤矿水的人工湿地系统中微生物的多样性进行分析。
将RFLP的结果与先前的有机体培养PCR-DGGE和FISH研究结合起来，说明了相对低的微生物多样性及嗜温硫杆菌在好氧湿地基质中具有优势。
Ishida等通过T-RFLP方法测定不同的水力负荷及水位波动对湿地底泥中微生物结构的影响，并根据营养物的去除情况确定湿地的性能。
Searcy等利用PCR扩增每个生物菌膜样本上真核细菌的16SrDNA及亚硝酸还原酶基因，用T-RFLP
技术分析扩增产物判断整个菌群及反硝化细菌群落的多样性。
Sleytr等利用
T-RFLP技术分析比较芦苇湿地和芒竹湿地植物根区的微生物群落结构，发现不同的湿地在相似的条件下运行具有相似的菌群结构。
4PCR-SSCP（SingleStrandConforma-tionalPolymorphism）
4.1PCR-SSCP基本原理
单链构象多态性技术（简写为SSCP）是随着人类基因组的研究而发展起来用于检测碱基突变的技术。
通过与PCR方法相结合，PCR扩增产物经变性后，将得到具有二级构象的单链DNA置于非变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，空间构象不同的单链DNA会因其迁移率不同而得到分离，最后根据电泳条带所显示的亮度、丰度、条带位置和清晰度等基本信息进行SSCP图谱分析，确定不同菌
株类型及其相对数量关系等从而检测相应的遗传变异。
PCR-SSCP技术被认为是
环境微生物分子生态学研究中，继变性梯度凝胶电泳（DGGE）和末端限制性片段
长度多态性（T-RFLP）之后的又一技术。
4.2PCR-SSCP在人工湿地中的应用
谢冰等（2007）采用PCR-SSCP技术对上海梦清园芦苇人工湿地的底泥微生物群落结构进行了研究，发现湿地中微生物优势种主要是七种芽孢杆菌。
XIEB等（2009）再次利用PCR-SSCP图谱分析上海梦清园芦苇人工湿地进出口微生物的多样性，得出异养菌、硝化细菌和反硝化细菌各个季节的分布不一，微生物功能群的分布与湿地中不同营养水平有关。
Vacca等（2005）利用PCR-SSCP图谱分
析六个处理生活污水的实验型人工湿地进出口、植物根区及基质不同深度的微生物群落的多样性，以判断湿地中填料类型、植物种植与否对菌群的影响，结果发现不同的微生物群落的存在与基质类型有关。
5ARDRA（AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis）
扩增rDNA限制性酶切片段分析法（简写为ARDRA）的技术原理是基于PCR技术选择性扩增rDNA片段（如16SrDNA、23SrDNA、16S-23SrDNA片段），再对扩增的rDNA片段进行限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）。
该方法的步骤是：
1）提取总DNA;2）以总DNA为模板，引物为rRNA基因的保守序列，采用PCR技术将特定的rDNA片段扩增出来；3）选择多种有四对碱基识别位点的限制性内切酶，对扩增产物进行限制性酶切;4）用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离酶
切的DNA片段；5）对ARDRA诊断谱带进行认定、特性的系统分析及计算机聚类。
ARDRA技术一般都需要同其它的分子技术如DGGE、T-RFLP等相结合使用。
Ibekwe等在变化植物密度和组成的湿地中研究微生物群落的组成与水质之间的关系，六个月中每星期对湿地的不同位点的水化学指标、硝酸盐、正磷酸盐、悬浮固体进行检测。
发现50%的植物覆盖率能将96.3%的硝酸盐去除。
采用DGGE获得总的DNA的群落图谱以测定湿地基质中、植物根区及水中主要的微生物组成，并建立菌克隆文库，其中300多个克隆体用
ARDRA分析并整合到运算分类单位中，得出湿地基质中、植物根区及水中分别有35、31、36个不同的分类单位，根据香农威尔指数的计算说明50%植物覆盖率的微生物多样性比100%的要高。
土壤微生物群落和数量鉴定的方法
在陆地生态系统中，生活在土壤中数量庞大的微生物种群，与植物和动物有着明确的分工，主要扮演“分解者”的角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，担负着地球C、N、P、S等物质循环的“调节器”土壤养分植物有效性的
“转化器和污染环境的”净化器”等多方面生态功能］P］。
土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。
然而，随着近代工农业的发展，大面积土壤受到严重污染，导致了土壤微生物群落结构和多样性的变化，而这种变化会如何影响地上部分和地下部分生态系统的变化尚不清楚。
目前，对污染土壤微生物多样性的研究已引起国内外学者的极大重视。
土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传（基因）多样性、生态特征多样性和功能多样性。
目前，对污染土壤微生物多样性方面的研究仍较薄弱。
一方面是由于测定微生物种类的方法和技术还不是很成熟，不能全面地、准确地研究土壤微生物多样性状况。
另一方面是由于环境的高度异质性，时间和空间上的小环境随时发生变化］R］。
另外，栖息在土壤中的微生物种类繁多，生存状况复杂，而且个体微小，结构简单，缺乏可以区分的明显特征，尤其它们的组成和活动及其引起的许多生化过程，互相交替、互相影响，给土壤微生物数量、组成和生态分布的鉴定带来了许多困难。
本文回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法，包括生物化学技术和分子生物学技术［S］，将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述，以利于今后的研究。
1污染土壤微生物群落结构多样性的测定方法
1.1传统微生物平板培养方法传统的微生物平板培养法就是根据目标微生物选择相应的专性固体培养基进行分离培养，然后通过各种微生物的生理生化特征、外观形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型］T］。
平板计数法仍然是一个评价污染效应的有效方法。
Busse等用平板计数法研究了草甘膦除草剂对造林土壤中微生物群落结构及其代谢特性的影响，测定结果表明，草甘膦除草剂对细菌和真菌有毒害作用，提高除草剂含量，降低了培养基中存活细菌的生长速率和代谢多样性。
该方法也存在许多不足之处。
首先，微生物对培养基具有选择性，不可能用有限的几种培养基培养获得土壤中所有的不同生理类群的微生物，同时培养基的成分也影响微生物的生长状况。
其次，实验室的培养条件不可能用同一种方法同时满足所有微生物对温度、pH以及通气状况等条件的要求，从而用某一种特定条件不能培养出来那些不适应条件的微生物。
而且，许多微生物在环境变化过程中表现出一种”存活但不能培养”的状态，在这种状态下，细胞不能在传统的培养基上生长，但仍然处于存活状态，并在一定条件下可以恢复代谢活性并转入可培养的状态。
因而，利用平板培养法不可能全面地获得土壤中所有微生物的全部信息，只能获得一小部分土壤微生物群落。
迄今为止，只有不到1%的土壤微生物
能够被培养，而大多数只能存在而无法被培养。
因此，这种传统的平板培养方法只能作为一种辅助工具，需要结合现代生物技术方法才能更客观而全面地反映微生物群落结构的真实信息。
1.2磷脂脂肪酸FLFA谱图分析法
磷脂脂肪酸（PhospholipidFattyAcid，FLFA）是构成活体细胞膜的重要组成部分，其含量在自然条件下是相对恒定的。
不同类群的微生物能通过不同生化途径形成不同的FLFA，部分FLFA总是出现在同一类群的微生物中，而在其它类群的微生物中很少出现，细胞死亡后数分钟到数小时内细胞膜水解和释放磷脂，FLFA被降解，可以代表微生物群落中”存活”的那部分群体。
不同菌群的微生物生物量群落组成各不相同，每种样品具有独特的FLFA谱图（包括FLFA总量、组成），即具有专一性；不同样品的谱图之间差别很大，具有多样性。
FLFA谱图的变化能够说明环境样品中微生物群落结构的变化。
因此，磷脂脂肪酸分析十分适合于壤微生物群落的动态监测。
FLFA分析法是用氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液（1:
2:
0.8）提取土样的脂类，用柱层析法分离得到磷酸酯脂肪酸，然后经甲酯化后用气相色谱分析各种脂肪酸（C5-C20）的含量。
该方法在污染土壤的微生物群落组成和种群变化方面研究得到越来越广泛的应用。
Pennanen等模拟酸雨和重金属条件，用FLFA方法研究它们对林地土壤微生物群落结构各自作用和协同作用的影响。
用不同浓度的重金属污染林地的腐殖质土壤和农业耕地，然后检测其FLFA组成，对这两种土壤微生物群落的磷脂
脂肪酸成分、生物量和活性进行了研究。
表明微生物群落结构逐渐发生改变，但比生物量和活性的变化要小。
用FLFA方法发现Zn污染土壤中指示菌根真菌和放线菌的FLFA相对含量下降，微生物群落结构发生了变化。
Suhadolc等用FLFA分
析了在重金属污染土壤中改变重金属有效性对土壤微生物群落结构的影响，发现用磷灰石处理降低重金属有效性和补充重金属来提高其有效性两种方式均改变了土壤微生物群落结构。
该方法不需要对土壤微生物进行培养，可以直接提取原位土壤微生物群落的脂肪酸。
但其分析结果的准确性与微生物体内的磷脂脂肪酸是否提取完全、稳定以及实验过程是否造成污染等有很大关系。
概括起来有以下几个：
（1）温度波
动，温度的增加会带来磷脂双分子层流动性的增加，这会导致形成磷脂非双分子层相，进而影响细胞膜的渗透性。
FLFA成分发生适应性变化以改变膜的流动性变化是生物体内消除这些影响的机制之一。
（2）饥饿，营养状况的变化也有可能改变磷脂的含量，有学者对此进行了相关研究。
（3）标记性FLFA的非专一性，其变动会导致误差的产生。
而且该方法只能鉴定到微生物属，不能在种和菌株的水平上区分微生物。
2.3基于PCR的分子生物学技术
2.3.1扩增核糖体DNA限制性分析法（AEDRA）扩增核糖体DNA限制性分析法是一种DNA:
指纹技术，其原理是基于将保守区序列作为引物，用PCR扩增16srRNA基因，所得片段用限制性内切酶消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离。
此方法无需进行纯培养，具备特异性强，效率高的特点，因此广泛应用于污染土壤微生物群落结构及其多样性的研究。
Smit等用扩增的核糖体DNA:
限制性分析法研究了铜污染对土壤微生物群落的影响，发现微生物群落结构发生了明显的变化，与无污染土壤相比，受铜污染土壤的微生物多样性减少；还证明可培养部分的细菌只代表了总的细菌种群的一小部分；同时表明扩增的核糖体DNA:
限制性分析法
是一种非常理想的研究土壤微生物群落的方法，能为微生物生态研究提供有价值的信息。
Wenderoth等用扩增的核糖体DNA限制性分析法研究了重金属Zn对自养型细菌的影响，结果显示随着Zn浓度的增加，各土样中细菌的代谢多样性随之减少。
Moffett等用扩增核糖体DNA限制性分析法比较了Zn污染土壤与非污染土壤的微生物多样性，经限制性片段长度多态性分析，结果表明，Zn毒害胁迫明
显降低了细菌群落的多样性。
该方法的不足之处是一组（分类群）微生物在分析中可得到几个片段，造成分辨率较低。
2.3.3限制性片段长度多态性分析法（RFLP）PCR限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP），是将PCR引物中的一条加以荧光标记，反应后用合适的限制酶切、电泳分析，再根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同分析群落的结构及组成多样性。
该技术可以用来监测因环境改变，如污染等而引起的微生物种群的变化。
Sandai等用PCR-RFLP方法评价了重金属污染对土壤中可培养细菌和总细菌群落结构的影响，结果发现增加重金属浓度会降低细菌群落的多样性，同时证明了可培养细菌种群只代表了土壤细菌群落的一部分。
234末端限制性片段长度多态性分析法（T-RFLP）末端限制性片段长度多态性分析法是对AEDRA技术的改进。
土壤细菌的16S核糖体DNA和真菌核糖体DNA的ITS区域都是研究土壤微生物多样性非常重要的目标区域。
T-RFLP就是根据样
品中的这些目标区域DNA序列的不同或变化，进行PCR扩增后得到目标DNA片段，酶切后将会产生不同长度的限制性片段。
根据这些特异片段的数量可以判断微生物区系的多样性，还可根据已知序列鉴定到种。
通过比较不同样品间的异同，该方法能为评估土壤微生物多样性提供更敏感的数量化基础。
Turpeinen等用
T-RFLP方法研究了As、Cr、Cu污染土壤的微生物群落结构，结果揭示了微生物能对土壤重金属污染产生响应作用，并通过改变微生物群落结构和产生耐性的方式来维持其代谢活性。
该方法也存在一些缺陷：
（1）在T-RFLP的峰值图上，一个峰代表的有可能不只是一个种；
（2）样品中的总DNA的提取和限制性内切酶的选择是影响到析结果的关键因素；（3）随着片段长度的增加，测序仪检测分辨率降低等。
2.3.4核糖体基因间隔区分析法（RISA）核糖体基因间隔区分析方法是利用细菌群落概览图谱间的相似度对生态系统的空间异质程度进行定量分析。
RISA以
细菌16S和23SrDNA间隔片段（ITS）为研究对象，ITS片段的PCR扩增混合物用普通电泳即可分离并获得特异性的长度多态性图谱，这就是利用RISA概览图谱
描述细菌群落的基本原理。
Ranjard等用PCR-RISA分析法研究了Hg对细菌群落结构的影响，发现在Hg污染胁迫下，优势细菌种群的组成发生了变化，耐Hg细菌变多，细菌群落多样性减少。
该方法的一些不足之处也是不能忽视的。
如普通PAGE只能分离大小相差十几个BP的DNA片段，对于差别小到几个甚至一个bp的DNA片段则很难分辨。
因此该方法在精度上受到一定限制。
2.3.2变性/温度梯度凝胶电泳技术（DGGE或TEEG）同样大小的DNA,序列由于含有的碱基不同，各片段的Tm也就不同，甚至一个碱基对的不同，都会引起Tm很大的差异。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。
该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。
温度梯度凝胶电泳（TGGE）技术的基本原理与DGGE技术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCRR产物及目的片段。
根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的种类多少，可以分析土壤样品中微生物的多样性。
该技术最先由Muyzer等人引入研究土壤微生物基因多样性，现已被证实能够精确地反映出土壤微生物多样性，并广泛地应用于污染土壤微生物多样性的研究。
Kozdroj等用PCR-DGGE结合传统培养方法研究了根系分泌物对受不同程度重金属污染土壤的细菌群落结构多样性的影响，结果显示根系分泌物对重金属污染土壤的细菌种群发展具有显著的刺激作用；同时发现，淹水会促进优势种细菌的快速生长，降低群落结构的多样性。
Kehella等用PCR-DGGE方法研究了Cd污染对土壤微生物群落结构的影响，在高浓度Cd污染下，细菌群落也只发生了微小的变化，是由于有效Cd浓度过低，表明高浓度但低有效态Cd污染主要诱导微生物生理上的适应，而非群落结构的变化，一些生化指标对胁迫更加敏感。
滕应等用PCR-DGGE技术分析了重金属污染农田土壤细菌群落的多样性，其电泳图谱表明，PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好，可以明显反映出重金属复合污染导致了农田土壤微生物在基因上的损伤，影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度，改变了土壤环境的优势菌群，从而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。
Brim等用PCR-TGGE方法研究了Zn污染土壤的细菌群落，指出TGGE方法所显示的细菌群落多样性要高于用培养方法所获得的多样性。
该方法也有一些不足之处，如易受腐殖酸、不同（34萃取效率的干扰［#5］，而且花费时间较多、费用昂贵，还有代表性不强等。
3污染土壤微生物功能多样性的测定方法
由于微生物群落在污染土壤的有机质分解、N、C物质循环以及生物修复等方
面扮演着非常重要的角色，微生物功能多样性因此成为与分类学、基因多样性一样重要的研究因素。
目前，对土壤微生物多样性的研究主要集中于微生物群落结构多样性的研究，而对微生物功能多样性的研究则相对偏少，绝大多数对微生物功能多样性的研究主要采用基于碳素利用的BIOLOG微平板分析方法。
BIOLOG微平板分析方法是由美国BIOLOG公司于1989年发展起来的，最初应用于纯种微生物鉴定。
1991年，Garlanc和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究，并认为BIOLOG碳素利用法是一种较为先进的研究不同环境下的土壤微生物群落结构和多样性的方法。
该方法是根据土壤微生物对95种碳源的利用能力及其代谢差异情况来对化能异养细菌进行鉴定的系统。
BIOLOG微平板是一种多底物的酶联反应平板，由一个对照孔（仅有指示剂）和95个反应孔组成，每个反应孔装有不同的单一碳源底物和氧化还原染料四氮唑蓝作为指示剂，将土壤溶液接种到每一个微平板孔中，各孔中微生物利用碳源底物，呼
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