Folin酚法测定蛋白质含量.docx
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Folin酚法测定蛋白质含量
实验报告
综合试验（三）
Folin-酚法测定蛋白质含量
2010年6月3日
摘要：
本实验包括两个步骤，第一个步骤为制作标准曲线，第二个步骤为制备样品（牛奶和酪蛋白粗制品）并用Folin—酚法进行蛋白质含量的测定，得到酶原液蛋白含量为8923（ug/ml）；洗脱峰Ⅰ蛋白含量82.692（ug/ml）；洗脱峰Ⅱ蛋白含量121.923（ug/ml）；洗脱峰Ⅲ蛋白含量83.077（ug/ml）。
此次实验与理论值仍存着一定的偏差。
通过本次实验的操作以及对实验结果的分析，了解Folin—酚法准确测定蛋白含量的原理方法，以及其相关的影响因素。
一、实验目的：
1、测定实验中原液和洗脱液中蛋白质的含量
2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的操作。
二、理论背景：
Folin-酚试剂法包括两步反应：
第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。
Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。
此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
三、实验装置：
1．实验材料
原液，洗脱峰
2．仪器
（1）移液管（0.5mL、1mL、5mL）
（2）量筒
（3）分光光度计（4）移液管、移液枪
3．试剂（纯度均为分析纯）
（1）0.5mol/LNaOH
（2）试剂甲：
（A）称取10gNa2CO3，2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。
（B）称取0.5gCuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。
每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。
（3）试剂乙：
在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL蒸馏水，再加50mL85％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。
回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。
然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。
（4）标准牛血清白蛋白溶液：
在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。
（试剂已配好）
四、实验步骤
1、标准曲线的制作
（1）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：
取6支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液，做两组平行。
然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。
30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。
表1牛血清白蛋白标准曲线制作
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
牛血清白蛋白溶液（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
（2）标准曲线的绘制：
以牛血清白蛋白含量（μg/ml）为横坐标，以光密度平均值为纵坐标绘制标准曲线。
2、样品的制备及测定
从分离峰中各取1ml溶液，分别加入试剂甲5ml,混匀后放置10min，在各加试剂乙0.5ml，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定光密度，并记录数据。
五、注意事项：
进行测定时，加Folin试剂要特别小心，因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
六、实验结果：
表1-1标准牛血清白蛋白标准曲线数据处理
试剂
试管号
1
2
3
4
5
6
牛血清白蛋白溶液（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
牛血清白蛋白含量（ug/ml）
0
50
100
150
200
250
A650nm
0.000
0.133
0.275
0.383
0.511
0.648
（2）样品测试结果
管号
A650nm
I-1
I-2
平均
淀粉酶液
0.115
0.117
0.116
洗脱峰Ⅰ
0.214
0.216
0.215
洗脱峰Ⅱ
0.315
0.318
0.317
洗脱峰Ⅲ
0.216
0.215
0.216
本实验淀粉酶液稀释200倍
计算：
蛋白含量根据标准曲线得出方程y=0.0026X计算，
蛋白质含量按下式计算：
X（ug）=A*稀释倍数/K
蛋白含量（ug/ml）=X（ug）/体积（ml）
A------测得的光密度
K------标准曲线斜率
因此:
淀粉酶液蛋白含量0.116*200/（1*0.0026）=8923（ug/ml）
洗脱峰Ⅰ蛋白含量0.215*1/（1*0.0026）=82.692（ug/ml）
洗脱峰Ⅱ蛋白含量0.317*1/（1*0.0026）=121.923（ug/ml）
洗脱峰Ⅲ蛋白含量0.216*1/（1*0.0026）=83.077（ug/ml）
七、讨论
1、此次实验步骤较为简单，能较好的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；更加熟悉分光光度计的使用，并且测定出蛋白质含量。
总体实验较为成功。
2、误差分析
实验结果有一定的偏差，可能原因如下：
（1）样品所含各种氨基酸的比例与标准有所不同，而不同氨基酸比例不同对实验结果有影响，有的较大有的较小；
（2）加入乙液应立即不断振荡，每次实验振荡程度对显色结果有影响，而且时间不及时时造成的误差更大；
（3）所使用分光光度计的数值不稳，也会造成一定误差。
尤其是酪蛋白的实验中用已经比色的比色皿在其他仪器上误差加大，因为没有对照实验溶液，只好实验，误差加大了；
（4）比色皿不够清洁，30min时间未到就拿去分光光度计测也造成了一定误差。
思考题解答
1、查阅课本、参考书，试述有几种测定蛋白含量的方法，及其简要原理和优、缺点。
测定方法
原理
灵敏度
干扰物质
优点
缺点
凯氏定氮法
（Kjedahl法）
蛋白质中的氮通过硝化全部转变成无机氮，再通过分析化学的手段测出氮的含量，根据氮在蛋白质分子中的平均含量16％，即可求得样品中蛋白质含量
灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为2％
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）
硝化样品不需可溶对所有蛋白质的测量都是一致的
耗时繁琐
装置需大量样品
不是检测蛋白质而是检测氮缺乏专一性
双缩脲法
（Biuret法）
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中也能与Cu2+形成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白浓度成正比
灵敏度低
1～20mg
硫酸铵；
Tris缓冲液；
某些氨基酸
简便迅速
不受蛋白质特异性的影响
灵敏度较差
所需样品量在（0.2－1.7）mg/ml
紫外分光光度法
蛋白质分子中酪氨酸色氨酸在280nm左右具有最大吸收，由于在各种蛋白质中这几种氨基酸含量差别不大，所以蛋白质在280nm的吸收值与浓度具正相关
较为灵敏
50～100g
各种嘌吟和嘧啶；
各种核苷酸
方法简便
测定迅速
样品可回收
低浓度盐无干扰
若样品蛋白中酪氨酸含量与标准蛋白质相比较差别较大时，测定有一定误差，其他具有紫外吸收的物质有干扰
考马斯亮蓝G250染色法（Bradford法）
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律可在595nm处比色测定
灵敏度最高
1～5g
强碱性缓冲液；
TritonX-100;
SDS
操作简便迅速消耗样品量少
不同蛋白质之间差异大且标准曲线线性差
Folin-酚试剂法
蛋白质与铜在碱性条件下生成铜络合物，将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生的颜色深浅与蛋白质含量成正比
灵敏度高
5～100g
酚类、柠檬酸、巯（qiu）基化合物
反应灵敏，操作简单，显色作用较好
花费时间较长，干扰因素多，不稳定，反应只在极短时间内有效
预习时疑问解答
（1）为什么加入甲试剂混合后要在室温下放置10min?
答：
反应完全充分，已经优化的时间。
（2）为什么加入已试剂混合均匀后要30min后才进行波长测定?
答：
反应完全充分，已经优化的时间。
八、结论：
此次试验较为简单，利用蛋白质与铜在碱性条件下生成蛋白质-铜络合物，将磷钼酸-磷钨酸试剂，即Folin试剂还原，产生的颜色深浅与蛋白质含量成正比的原理进行实验。
我们得出的实验结果为酶原液、洗脱峰Ⅰ、洗脱峰Ⅱ、洗脱峰Ⅲ的蛋白含量分别为8923（ug/ml）、82.692（ug/ml）、121.923（ug/ml）、83.077（ug/ml）。
通过此次实验，学会了用Folin-酚法测定酶原液及洗脱峰中蛋白质含量的方法步骤，更加了解其原理。
此外，通过对不同测定蛋白质含量的方法的归纳与比较，让我更深入地了解了不同方法的优缺点，对以后的实验提供了很好的参考知识。
参考文献：
[1]倪莉，张雯，饶平凡编写的《生物化学实验指导书》2010年。
[2]张洪渊主编.生物化学教程（第三版）.四川大学出版社
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